武 艳，吴正升

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均呈逐年上升趋势，且发病年龄日趋年轻化[1]。目前，尚无有效的治疗方法控制乳腺癌的复发和转移，其复发和转移仍是导致患者死亡的主要原因[2]。因此，探索乳腺癌转移和复发的新机制，改善患者的预后至关重要。U2AF同源基序激酶1(U2AF homologous kinase 1, UHMK1)被证明可以与一系列蛋白结合，如eEF1A、FAM64、CDKI、p27KIP1、SF3b155和CPEB1，表明UHMK1在不同的细胞过程中发挥不同作用[3-4]。更重要的是，相关研究表明UHMK1表达异常与胰腺癌、卵巢癌及胃癌的发生、发展相关[5-7]。目前，关于UHMK1对乳腺癌的影响在国内外相关研究中尚未见报道。本实验使用shRNA干扰乳腺癌细胞系MDA-MB-231中UHMK1的表达，分析UHMK1对乳腺癌增殖和转移的影响，为进一步明确乳腺癌转移和复发的机制提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人胚胎肾细胞系293T均由中国科学技术大学朱涛教授惠赠；Leibovitz’s-L15培养基、DMEM培养基和胎牛血清(FBS)(美国GIBCO公司)；0.25%胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)和蛋白裂解液(碧云天生物公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；兔抗人UHMK1抗体、鼠抗人Actin抗体(武汉三鹰生物公司)，RNA逆转录试剂和实时荧光定量PCR试剂(全式金生物公司)。

1.2 细胞培养人乳腺癌细胞株MCF-7采用含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的Leibovitz’s -L15培养基在37 ℃、无CO2条件下培养。人胚胎肾细胞系293T采用含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基在37 ℃、含有5%CO2的条件下培养。

1.3 UHMK1-shRNA真核表达载体构建根据shRNA设计原则，靶向设计UHMK1的shRNA，UHMK1-shRNA#1：5′-CCGGGAGTGCAGAGAATGAATG TTTCTCGAGAAACATTCATTCTCTGCACTCTTTTT-3′，UHMK1-shRNA#2：5′-CCGGCCCATTCTTTAGCATTC CTTTCTCGAGAAAGGAATGCTAAAGAATGGGTTTTT-3′。退火处理：99 ℃起，每分钟下降1 ℃，直至4 ℃保存。用Solution Ⅰ连接酶将准备好的插入片段连接到已酶切且含有嘌呤霉素和氨苄抗性的载体Plko.1，转化到感受态细胞。……