杨怀玺,陈 林，苏妍卓，王雪峰，丁大勇

(吉林大学中日联谊医院 胃肠结直肠外科,吉林 长春130033)

随着肠道免疫功能研究的深入,肠道黏膜分泌的一系列具有抗菌作用的短肽受到了高度重视。这些短肽在胃肠道中对一定种类的有害病原体具有抑制或杀灭作用,对肠道正常菌群干扰较小,参与人体肠道黏膜屏障的功能。在既往研究中，本课题组利用生物工程技术重组表达、纯化了小鼠抗菌肽Reg3γ，掌握了该蛋白在大肠杆菌中表达的合适条件。HIP/PAP是其同源的由人肠道潘氏细胞分泌的抗菌肽，本文利于该技术进一步表达和纯化了HIP/PAP，并对其抗菌作用进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

载体质粒pET-30b(+)购自Novagen公司；限制性内切酶、DNA聚合酶购自TaKaRa公司；真核表达菌株E.coli B21购自Agilent公司；感受态细胞DH5α，购自TaKaRa公司；粪肠球菌(E.faecalis)和大肠杆菌(E.coli)由本实验室保存的菌种；透析袋购自Spectrum Laboratories公司；阳离子交换柱及凝胶柱购自GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1真核表达载体的构建 HIP/PAPmRNA引物设计序列：上游引物：5’- ATTGCGAGGCATATGGAAGAACCACAAAGAGAACTGC-3’；下游引物：5’-CTATGGTGATCACTAGTCAGTGAACTTGCAGACATAGGGTAA-3’，引物上下游分别包含NdeI酶切位点和BclI酶切位点。PCR反应条件为：94℃2 min;94℃20 s、60℃30 s、72℃30 s行30个循环，72℃5 min。

将HIP/PAP PCR产物和原核表达载体为pET-30b(+)质粒行NdeI和BclI双酶切。酶切后的目的片段和载体通过DNA连接酶将连接成pET-30b(+)-HIP/PAP。常规扩增抽提重组质粒pET-30b(+)-HIP/PAP。对扩增的质粒行双酶切鉴定及测序。将重组的pET-30b(+)-HIP/PAP转化真核表达载体E.coli B21-CodonPlus(DE3)在含有卡那霉素(30 μg/mL)和氯霉素(50 μg/mL)的LB培养基培养，低温保存真核表达载体。

1.2.2重组蛋白的表达及纯化 根据既往研究Reg3γ的实验条件表达重组蛋白。将真核表达载体E.coli B21-CodonPlus(DE3)挑菌到20 mL含卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基，小规模制备。……