李秀文，赵桂香

(新疆医科大学第六附属医院，新疆 乌鲁木齐830000)

肾细胞癌(RCC) 简称肾癌，是常见的恶性肿瘤之一，发病率位居泌尿系统肿瘤中第三位[1-2]。肾癌在临床上缺乏典型的症状和早期筛查的指标，大约有16%的肾癌患者在确诊时已经发生了转移[3]。FOXN2(Forkhead Box N2)是FOX家族转录因子中的成员之一，与FOXN3是类似物。研究显示[4-5]，FOXN3在恶性肿瘤中表达下调，表明FOXN3可能是重要的肿瘤抑制基因。本研究通过FOXN2对肾癌细胞增殖、凋亡的影响，期望能为肾癌的靶向治疗提供新的思路，寻找肾癌治疗的新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肾癌细胞(786-O)及正常肾小管上皮细胞(HK2)均购买于中国科学院细胞库。

1.2 主要实验材料

胎牛血清及RPMI1640培养基购自美国Roswell公司。pcDNA3.1、pcDNA3.1-FOXN2载体(丰晖生物)。FOXN2基因(北京义翘神州)。Lipofectamine2000转染试剂(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。PI3K Antibody、AKT Antibody、p-AKT Antibody、Bcl-2 Antibody、Bax Antibody、CDK1 Antibody、CyclinD1 Antibody试剂盒均购于Cell Signaling公司，CCK8、Western一抗及二抗稀释液、去除液、显影定影试剂盒都购买于艾博抗(上海)贸易有限公司。RT-PCR 仪购自美国BD 公司。HBS-1096B 酶标仪购自瑞士Tecan公司。Western blot电泳仪购于美国Bio-Rad公司。

1.3 实验细胞处理及分组

实验设置FOXN2过表达组、空载体对照组、对照组三组。通过Lipofectamine2000将pcDNA3.1-FOXN2、pcDNA3.1转染肾癌细胞786-O，对照组细胞不做处理。

1.4 通过PCR和Western blot检测FOXN2在人正常肾上皮细胞HK-2和肾癌细胞786-O中的表达

786-O细胞及HK-2 细胞均种植于RPMI1640 培养基，在37℃、5% CO2培养箱中培养，48 h 后消化传代。采用qRT-PCR法检测各细胞中的FOXN2，以U6小核RNA作为内参，以2-ΔΔCt表示FOXN2相对表达量。

1.5 通过CCK8及克隆形成实验检测FOXN2过表达组、空载体对照组、对照组细胞增殖情况

将FOXN2过表达组、空载体对照组、对照组细胞消化成单细胞悬液后，以2×103个/孔将种植于96 孔板上，每孔培养基体积200 μL，分别于培养0、24、48、72、96 h后，每孔加入20 μL的CCK-8溶液，继续培养1 h，在450 nm波长下用酶标仪测定各孔光密度值(OD值) ，以此表示细胞增殖能力。以时间为横坐标、OD值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。

1.6 通过流式细胞仪检测FOXN2过表达组、空载体对照组、对照组细胞凋亡情况

离心收集悬浮细胞(≥1×105)，4℃预冷 PBS 缓冲液0.5 h，洗涤沉淀 2-3 次。1-2 mL PBS缓冲液重悬细胞沉淀成单细胞悬液并细胞计数板计数。将细胞悬液分装至棕色EP 管中(≥1×105)，随后加入 500 μL 1× Annexin V 结合液。加入 5 μL Annexin V-FITC/EP 管，轻轻混匀后置于4℃避光条件下孵育15 min。加入5 μL PI染色液/流式管后轻轻混匀后置于 4℃避光条件下孵育5 min。将上述经过处理的细胞在流式细胞仪上检测。设置激发波长为 488 nm，Annexin V-FITC 绿色荧光通过 FL1 通道检测；PI 红色荧光在 620 nm，通过 FL2通道检测。

1.7 通过Western blot 检测FOXN2过表达组、空载体对照组、对照组细胞中PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax、CDK1、CyclinD1蛋白表达水平

根据分组设置3个复孔。处理24 h后的细胞用于提取蛋白，Western blot检测。将FOXN2过表达组、空载体对照组、对照组三组细胞裂解、变性，取 20-30 μL蛋白提取液用于蛋白 BCA 定量。将稀释好的 BSA 标准品、待测蛋白样品以25 μL/孔分别加入 96 孔板微孔中，每个样本设置 3 个复孔。每孔加入 200 μL BCA 工作液，37℃恒温水平摇床中孵育 30 min，将酶标仪波长设置为 562 nm，测定每个孔的吸光度值(OD 值)。根据 A-G 标准品的 OD 值绘制标准曲线，根据标准曲线计算蛋白样品的浓度。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 HK-2细胞和786-O细胞中FOXN2表达变化

与HK-2细胞相比，786-O细胞中的FOXN2蛋白表达显著下降，差异具有统计学意义(P<0.001)。与对照组相比，空载体组786-O细胞中FOXN2蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；FOXN2过表达组786-O细胞中FOXN2蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图1。

2.2 各组细胞增殖能力比较

与对照组相比，在0、24、48、72和96 h空载体组786-O细胞增殖OD值无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；在48、72和96 h FOXN2过表达组786-O细胞增殖OD值明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3 各组细胞凋亡情况比较

与对照组相比，空载体组786-O细胞凋亡率无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；FOXN2过表达组786-O细胞增殖OD值明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图1 HK-2细胞、786-O细胞及空载体和过表达786-O细胞的FOXN2蛋白表达

图2 786-O细胞及空载体和过表达786-O细胞的增殖

图3 786-O细胞及空载体和过表达786-O细胞的凋亡率

2.4 各组细胞中蛋白表达水平

与对照组相比，空载体组786-O细胞PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax、CDK1和CyclinD1蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；FOXN2过表达组786-O细胞p-AKT、Bcl-2、CDK1和CyclinD1蛋白表达明显降低，Bax蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 786-O细胞及空载体和过表达786-O细胞的蛋白表达

3 讨论

肾癌作为高侵袭性的疾病，在目前已知的肿瘤中，发病率排名第13位[6]。早中期肾癌治疗的主要手段仍然是手术，晚期肾癌对放疗、化疗大部分表现为不敏感，靶向治疗对于晚期肾癌的患者，五年生存率不能得到明显的提高[7]。

FOX家族是转录因子家族，近年来，作为与癌症相关蛋白的角色在许多研究报道中频频出现。有研究者通过基因检测方法发现，FOXN3基因的上调和沉默可以影响N 钙黏蛋白、Snail和c-Myc的相关表达量。β-连环蛋白/TCF信号通路通过FOXN3表达量的下降而激活，结肠癌肿瘤细胞从而加速发展[8]。此外，在纵隔原发人B 细胞淋巴瘤，FOXO1起到了肿瘤抑制的作用[9]。在乳腺癌HER-2 过表达组，PI3K/AKT 的活性受FOXO1A阻滞，从而减慢了癌细胞的生长速度[10]。综上所述，这些FOX亚家族蛋白发挥着抑癌作用。有研究人员发现：在胃癌及宫颈癌细胞中，FOXM1 和血管内皮生长因子VEGF的表达呈正相关，VEGF 的表达通过FOXM1影响而上调，大量的新生血管生成，进而促进肿瘤的生长和迁移[11]。因此，FOXM1是一个癌蛋白，促进癌的发展。

本文就FOX 家族中的一个亚家族--FOXN2蛋白进行研究，通过它过表达对肾癌细胞增殖、凋亡的影响做了深入的探索。首先，初步确定了 FOXN2 基因在人正常肾小管上皮细胞和人肾癌细胞里的表达差异，本研究结果显示：人肾癌细胞(786-O)及正常肾小管上皮细胞(HK2)中的 FOXN2 基因在mRNA水平上的表达有极显著的统计学差异(P<0.01)。786-O 中的 FOXN2 基因在 mRNA 水平的表达比HK2中的极显著降低。为了探究 FOXN2 对肾癌细胞生长增殖，凋亡情况等多种生物学功能的影响，本实验用脂质体细胞转染法将FOXN2 基因导入 786-O中，使得FOXN2 在细胞中高表达，并首先检测这种方法的转染效率。结果显示，在实验组细胞转染48 h 后，FOXN2过表达组的细胞 FOXN2 的表达量与空载体对照组和对照组细胞的表达量有极显著的统计学差异(P均<0.01)。转染了 FOXN2 实验组的细胞中，FOXN2在mRNA水平上的表达量比空载体对照组的表达量极显著提高了。在实验组细胞转染72 h后，FOXN2过表达组的细胞FOXN2蛋白的表达量与空载体对照组和对照组细胞的表达量有极显著的统计学差异(P均<0.01)。转染了 FOXN2实验组的细胞中，FOXN2 在蛋白水平上的表达量比对照组和空载体对照组中细胞FOXN2的蛋白表达量极显著提高了。CCK-8检测的第一天和第二天，三组细胞的生长增殖情况没有差异。48 h后开始，转染了 FOXN2基因的细胞生长增殖能力和不处理的对照组细胞有了显著差异(P<0.05)。FOXN2过表达组细胞的生长增殖速度明显低于其他两组的细胞。由此说明 FOXN2过表达对肾癌细胞的生长增殖起到了抑制作用，在一定程度上，减缓了肾癌细胞的恶性增殖。FOXN2过表达组细胞凋亡率与对照组相比也明显增加。

综上所述，通过对细胞生物学功能方面的检测得出 FOXN2 过表达影响着细胞的生长增殖、凋亡，FOXN2 是一个抑癌基因，发挥着抑癌作用，它可能成为一种新的肾癌治疗靶点。研究结果显示，FOXN2过表达组p-AKT、凋亡抑制因子Bcl-2、CDK1、CyclinD1蛋白表达降低(P<0.05)，Bax的表达明显增高，由此可见，FOXN2可能与 PI3K-AKT 通路存在关联。