吕 荼，王新刚，黄 鹏，黄岚峰

(1.辽阳市中心医院 骨科，辽宁 辽阳111000；2.吉林大学第二临床医院 骨科)

骨肉瘤属于原发恶性肿瘤，在所有骨肿瘤中所占比例约为20%，好发于儿童与青少年[1]。在手术技术、辅助放化疗方式不断进步条件下，骨肉瘤患者5年生存率已从以往20%升高至60%左右[2]。有报道称，大部分骨肉瘤患者死亡直接原因为肿瘤细胞转移，无转移者术后5年生存率高达70%，一旦产生转移现象，5年生存率则降至30%以下[3]。近年来，有报道miR-449a能够靶向生长因子受体(c-Met)，对人体肿瘤细胞生长、侵袭以及转移起到调控作用[4]。本文主要分析骨肉瘤患者miR-449a表达水平及其与临床病理参数、患者预后的关系，希望为临床提供一定指导依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取辽阳市中心医院2013年3月至2016年5月收治的108例骨肉瘤患者。纳入标准：(1)与骨肉瘤诊断标准[5]相符，且经术后病理学结果确诊；(2)初诊初治患者；(3)具有手术适应症，同意手术治疗；(4)具有完整临床与随访资料；(5)签署研究知情同意书。排除标准：(1)哺乳或妊娠期病例；(2)合并重要器官功能障碍、心脑血管疾病、凝血功能障碍、自身免疫功能障碍或者其他恶性肿瘤；(3)入院前已经有抗肿瘤治疗史；(4)合并精神类疾病。研究经本院伦理委员会审批。取患者骨肉瘤组织为实验组，瘤旁正常骨组织作为对照组。

1.2 方法

1.2.1临床资料调查 调查并统计患者性别、年龄、病灶位置、组织学分型、肿瘤分期(按照Enneking外科分期)、软组织浸润及远处转移情况等。术后对患者进行4年随访，记录其累积生存率。

1.2.2miR-449a表达检测 采取荧光定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测患者骨肉瘤组织与瘤旁正常骨组织miR-449a表达水平。首先利用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)提取冻存组织之中总RNA。采取反转录试剂盒(购自TaKaRa公司)对所取RNA进行反转录，获得互补DNA(cDNA)。然后，利用SYBR Green(购自TaKaRa公司)予以实时PCR分析。 采取ABI7500系统完成qRT-PCR检测过程。内参选择U6，U6与miR-449a引物序列具体见表1。

表1 引物序列

PCR具体反应体系为：采取10×Buffer与浓度2.5 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)分别5 μL、4 μL，Pmix与taq酶分别2.5 μL、0.5 μL，上游以及下游引物各1 μL，双蒸水36 μL。控制反应条件为：94℃条件下预变性2 min，变性 25 s，然后60 ℃退火处理35 s，72℃连续延伸20 s，总共31个循环。通过公式：2-ΔΔCt，得到miR-449a相对表达量，该公式中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。以骨肉瘤miR-449a相对表达量平均值为分界，分为高水平组与低水平组。

2 结果

2.1 2组miR-449a表达水平比较实验组miR-449a表达水平明显低于对照组(P<0.05)。见表2。高水平miR-449a表达42例，低水平表达66例。

表2 2组miR-449a表达水平比较

2.2 高水平组与低水平组临床资料比较见表3。miR-449a表达与患者性别、年龄、病灶位置、组织学分型无明显关系(P>0.05)，与肿瘤临床分期、软组织浸润、远处转移关系明显(P<0.05)。

表3 高水平组与低水平组临床资料比较(n)

2.3 miR-449a表达与患者预后关系4年随访发现，miR-449a表达高水平组生存34例(80.95%)，死亡8例(19.05%)；低水平组生存40例(60.61%)，死亡26例(39.39%)。图1为Kaplan-Meier生存曲线，低水平组中位生存时间明显短于高水平组(P<0.05)，累积生存率显著低于高水平组(χ2=4.767，P=0.029)。

图1 miR-449a表达与预后关系

3 讨论

骨肉瘤发生、发展和人体多种致癌或者抑癌基因有关，这些基因表达异常主要通过调控细胞增殖与转移的方式参与肿瘤发展[6]。以往研究表明，miRNA谱系表达水平异常与癌症紧密相关，如胃癌、骨肿瘤、乳腺癌以及结肠癌等[7]。故临床认为，肿瘤组织里面miRNA表达能够作为患者诊治、预后判定新靶点。

有报道称，人体内多种miRNA表达异常和骨肉瘤发生、发展以及转移存在密切联系[8]。miR-449集群主要分布在5号染色体q11.2的细胞分裂周期蛋白20B抗体(CDC20B)第2个内含子，该区域是癌症易感性位点，人体miR-449表达异常可能与肿瘤病灶产生以及发展有关。miR-449集群编码的成熟miRNAs(包括miR-449a、miR-449b和miR-449c)均能够对细胞周期阻滞与细胞凋亡产生介导作用，从而抑制细胞存活与癌组织生长[9]。miR-449a属于细胞凋亡与分化、细胞周期阻滞等环节有效诱导物，在肿瘤生长、增殖以及分化中发挥着重要作用[10-11]。相关研究指出，miR-449a在骨肉瘤、胶质瘤、肺癌以及肝癌等进程中主要通过抑制B细胞淋巴瘤/白血病-2(BCL2)的方式诱导凋亡[12]。亦有实验研究表明，miR-449a可对癌细胞增殖产生抑制作用，同时有效促进细胞凋亡[13]。本研究中，实验组miR-449a表达水平明显低于对照组，表明骨肉瘤组织miR-449a表达下调，说明骨肉瘤发生发展过程中miR-449a可能发挥抑癌基因作用。有实验结果表明miR-449a表达上调可以造成肝癌细胞凋亡速率升高与增殖减少，如果miR-449a表达下调，会产生相反效果，认为miR-449a 表达情况可能对胃癌患者病情发展产生影响[14]。本研究发现， 高水平组与低水平组在肿瘤临床分期、远处转移以及软组织浸润等方面有明显差异，表明miR-449a表达下调与肿瘤进程、转移与浸润情况有关，可能由于miR-449a在癌症患者中对细胞周期造成的影响不仅可使蛋白质控制紊乱以及生长因子表达水平提高，同时能够使其受体失调，以此参与骨肉瘤侵袭和转移过程。除此之外，miR-449a可以绑定基因启动子，对其下游信号通路产生影响，从而控制其活性。BCL2属于抗凋亡分子，亦为miR-449a直接靶基因，低表达miR-449a可以通过减弱BCL2表达的方式促进凋亡，从而参与骨肉瘤的发生与发展[15-16]。有研究指出，miR-449a高表达可以明显改善胃癌患者预后情况[17]。本文生存分析显示，低水平组中位生存时间明显短于高水平组，表明miR-449a表达水平与骨肉瘤患者预后相关，高水平者预后较好，可用于骨肉瘤患者预后评估。

综上，骨肉瘤患者瘤组织miR-449a表达下调，与患者病理特征(临床分期、转移及浸润等)有关，同时miR-449a低表达水平和患者不良预后具有紧密联系，能够用于预后判定。