刘 妍，张萍淑，2，吴宗武，王贺永，张淑青，元小冬，2*

(1.华北理工大学附属开滦总医院 a.神经内科;b.检验科,河北 唐山063000;2.河北省神经生物机能重点实验室，河北 唐山063000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)是引发各种类型院内感染和社区获得性感染最主要的病原菌，在病房环境中有着很强的传播和定植能力[1-2]。研究指出肺炎克雷伯菌易于在抗菌药物的选择性压力下产生超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)，而且产ESBLs的病菌质粒上可以有喹诺酮类、氨基糖苷类等多种耐药基因，对多种抗菌药物产生多药耐药甚至泛药耐药性，并且可通过染色体垂直克隆及质粒水平转移等方式进行传播，引起相当严重的医院感染[3]。本研究拟通过肺炎克雷伯菌株染色体及质粒中DNA携带的主要耐药基因型检测，同时结合抗菌药物敏感性试验，研究肺炎克雷伯菌携带的耐药基因特征与临床耐药性的关系，从而明确耐药基因的传播特征，以指导临床感染的防控及临床抗菌药物的应用。

1 材料与方法

1.1 实验方法收集某三甲医院神经内科重症监护病房(Neurological intensive care unit,NICU)中2015年1月-2018年12月住院的感染患者，对引发感染的KP病原菌以及此类感染患者居住病房的病床单位和空气环境中肺炎克雷伯菌的分布状态进行监测。同时，对于入选本项研究的NICU病房空气环境的KP定植情况进行常规监测。

1.2 感染患者的样本采集

NICU中诊断感染的患者，依照规范化实验标准于24 h内进行病原学检查，采集与感染部位相关的(血、尿、便、痰或其他分泌物)标本送检。

1.3 NICU环境监测的样本采集

1.3.1NICU感染患者病房环境的细菌学监测 在患者确诊感染后24 h内对确认感染患者的周围空气和包括床头柜表面、病人的枕头、被子表面的病床单位环境，按照规定程序使用采样器进行感染环境的样本采集。

1.3.2NICU病房常规空气环境的细菌学监测 对于NICU病房的空气环境，按照规定的操作流程于每个月第2和4周的周二上午9:00-10:00对病房(6人间、2人间各1个房间)空气环境进行常规的样本采集。

1.4 细菌的培养、鉴定及药物敏感性试验

将NICU感染患者周围环境、常规空气环境中采集的标本于37℃恒温箱中培养48 h，计算细菌菌落数，革兰氏染色确定其革兰氏属性，对不同种类的细菌进行分离培养。分离培养的菌株用全自动细菌鉴定仪依据《全国临床检验操作规程》(第三版)进行菌种鉴定，收集感染患者临床标本中首次分离和环境中定植的KP菌株，在-80℃专用冰箱中保留备用。依据CLSI/NCCLS标准进行K-B纸片法测定21种临床常用抗菌药物的敏感性并进行ESBLs表型确证试验。标准化质控菌株为ATCC700603。

1.5 KP的耐药基因检测

1.5.1细菌的染色体模板制备 将KP菌株的菌落捣碎悬浮于双蒸水600 μL中,100℃煮沸15 min，12 000 rpm，离心5 min，吸取上清液作为模板，-20℃保存备用。

1.5.2细菌的质粒模板制备 KP菌株接种于9 mL LB肉汤培养液中，放于37℃水浴箱中避光震荡培育18 h后，严格依据质粒小提中量试剂盒(天根生物科技有公司)标准操作流程提取质粒DNA，得到的质粒DNA经琼脂凝胶电泳法确证后，放置于-20℃冰箱中保留备用。

1.5.3目标基因检测 运用聚合酶链反应扩增法(PCR)，对β-内酰胺类(SHV、TEM、CTX-M、IMP、KPC、OXA-1-like)、喹诺酮类[qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-Ib-cr]药物的耐药基因进行检测。(1)染色体DNA扩增体系(共25 μL)：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,模板DNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 9.5 μL。(2)质粒DNA扩增体系(共25 μL)：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,模板DNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 8.5 μL。热循环反应程序：95℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 10 μL。产物经琼脂糖凝胶电泳显现出与目的基因片段大小完全相同条带者判定为阳性。引物序列及扩增片段大小参照文献[4]。

1.6 数据统计与分析

采用Excel 2007建立数据库，SPSS 17.0软件进行数据统计与分析。计数资料用例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NICU的病原学和病房环境采样标本的KP监测结果

共检测到非重复KP菌株106株，来源于临床病原学标本93株(标本类型为痰88份、血1份、阴道分泌物1份、尿液3份)、感染患者的周围病房环境标本11株(非KP类感染患者的周围空气环境监测标本3株、KP类感染患者的周围空气环境监测标本4株、非KP类感染患者的床头柜监测标本1株、KP类感染患者的被子表面1株、非KP类感染患者的被子表面1株、KP类感染患者的枕头表面1株)、病房空气环境常规监测标本2株。

2.2 KP的药物敏感性试验结果(见表1)

全部KP中ESBLs(-)菌株包括84株患者感染的病原菌株和12株环境采集标本菌株，呈现对氨苄西林100%耐药，哌拉西林56.25%耐药，而对其他抗菌药物高度敏感。ESBLs(+)菌株包括9株患者感染的病原菌和1株环境中采集的菌株。

表1 KP菌株的药物敏感性试验结果[n(%)]

2.3 KP的耐药基因检测结果

2.3.1病原性及环境定植KP染色体与质粒中DNA的耐药基因检测结果比较 (1)病原性KP质粒DNA组与染色体DNA组耐药基因检测结果比较β-内酰胺类中CTX-M-2(χ2=5.534，P=0.019)具有差异；OXA-1-like(χ2=14.39，P=0.002)具有显著差异；喹诺酮类中qnrA(χ2=12.9，P=0.003)、aac(6′)-Ib-cr(χ2=12.5，P<0.001)具有显著差异。(2)环境定植KP染色体DNA耐药基因与质粒DNA组耐药基因检测结果比较β-内酰胺类中KPC(χ2=11.424，P=0.007)、SHV(χ2=34.882，P<0.001)、TEM(χ2=22.012，P<0.001)、IMP(χ2=8.589，P=0.003)、CTX-M-1(χ2=11.424，P=0.007)具有显著差异，CTX-M-2(χ2=5.307，P=0.021)具有差异；喹诺酮类qnrB(χ2=4.751，P=0.029)具有差异，aac(6′)-Ib-cr(χ2=8.589，P=0.003)具有显著差异。见表2。

表2 病原性及环境定植KP染色体与质粒中DNA的耐药基因检测结果[n(%)]

2.3.2产ESBLs与非产ESBLs KP菌株染色体DNA携带耐药基因与质粒携带耐药基因结果比较 (1)产ESBLs与非产ESBLs KP菌株质粒DNA耐药基因携带阳性率结果相比β-内酰胺类中KPC(χ2=8.665，P=0.003)、TEM(χ2=75.947，P<0.001)、IMP(χ2=27.121，P<0.001)、CTX-M-1(χ2=24.533，P<0.001)、CTX-M-9(χ2=90.133，P<0.001)具有显著差异；喹诺酮类中qnrS(χ2=22.816，P<0.001) 、aac(6′)-Ib-cr(χ2=11.171，P<0.001)具有显著差异；(2)产ESBLs与非产ESBLs KP菌株染色体DNA耐药基因携带阳性率结果相比β-内酰胺类中KPC(χ2=8.665，P=0.003)、SHV(χ2=10.653，P=0.001)、TEM(χ2=54.319，P<0.001)、IMP(χ2=17.239，P<0.001)、CTX-M-9(χ2=104.637，P<0.001)具有显著差异；CTX-M-2(χ2=5.534，P=0.019)具有差异；喹诺酮类中qnrA(χ2=8.665，P=0.003)、qnrS (χ2=39.046，P<0.001)、aac(6′)-Ib-cr(χ2=32.637，P<0.001)具有显著差异。见表3。

表3 产ESBLs与非产ESBLs KP菌株质粒及染色体DNA耐药基因携带阳性率结果[n(%)]

3 讨论

KP是肠杆科菌中最常见的致病菌，同时也是神经危重症患者的主要治病菌之一，影响因素多，了解其临床耐药特征及其变化规律，控制其感染，成为临床关注的重点[5-6]。通过对NICU中KP临床耐药性的监测与分析，了解NICU中KP耐药基因的遗传机制、传播特点，才能减少其临床耐药性产生，有效控制KP的传播。

产ESBLs肺炎克雷伯菌耐药率高，耐药形势严峻，SHV是重要的基因分型[7-8]。本研究结果显示全部KP均对氨苄西林耐药，对哌拉西林的耐药率也较高。染色体DNA上β-内酰胺类SHV耐药基因，在病原性KP中阳性率高达96%，在环境检出KP中阳性率达77%；位于第二位的CTX-M-2耐药基因，在病原性KP中阳性率为16%，在环境检出KP中阳性率为23%；位于第三位的TEM和位于第四位的KPC，在病原性KP中阳性率为9.67%和8.6%，但是这两种耐药基因在环境检出KP中均未检测到。其他目标基因的检出率更低，甚至检测不到。本研究结果与Ashayeri-Panah M的研究结果相似[9]。所以，KP染色体DNA上携带β-内酰胺类SHV基因是其对氨苄西林、哌拉西林高度耐药的重要原因。

质粒是捕捉、传播耐药基因的重要载体，在耐药基因水平传播中发挥着重要作用[10-11]。本研究结果显示病原性KP和环境检出KP的质粒中均有β-内酰胺类SHV基因，也可检测出KPC、CTX-M-2、CTX-M-9、OXA-1-like、TEM、CTX-M-1、IMP基因。并且，病原性KP质粒上的OXA-1-like、CTX-M-2基因的阳性率与环境检出KP质粒中的阳性率无明显差异，但却明显高于其染色体DNA该耐药基因的阳性率。同时，在ESBLs(+)和(-)KP质粒中也均检测到这些基因。提示这些β-内酰胺类基因在ESBLs(+)和(-)KP株中均与质粒的水平传播有关。病原性KP和环境检出KP的质粒中均没有发现喹诺酮类qnrA基因，但是acc(6′)-Ib-cr基因在质粒中的阳性率却明显高于染色体DNA，进一步分析发现ESBLs(+)KP质粒中acc(6′)-Ib-cr和qnrS基因的阳性率均明显高于ESBLs(-)KP，说明喹诺酮类qnrA基因通常不通过质粒在病房环境进行水平传播；而acc(6′)-Ib-cr等其他基因具有很强的质粒水平传播能力，是产生KP耐药性及其传播的重要途径。研究表明ESBLs(+)KP的质粒上喹诺酮类耐药基因aac(6′)-Ib-cr检出率很高，并且aac(6′)-Ib-cr耐药基因可以通过质粒水平传播，造成KP的流行[12-13]。

研究表明产ESBLs肺炎克雷伯菌中最常见的ESBL耐药基因是CTX-M[14-15]。本研究结果显示染色体DNA上KPC耐药基因在ESBLs(+)的KP中阳性率为20%，在ESBLs(-)的KP中阳性率为6.25%；β-内酰胺类CTX-M-9耐药基因在ESBLs(+)的KP中阳性率为70%，但在ESBLs(-)的KP中未检测出。然而，喹诺酮类qnrS、acc(6′)-Ib-cr、qnrA耐药基因在ESBLs(+)的KP中检出率分别为60%、40%、20%，均明显高于ESBLs(-)的KP菌株。所以，KP染色体DNA所携带的β-内酰胺类CTX-M-9基因和喹诺酮类qnrS、acc(6′)-Ib-cr、qnrA等多种基因均与产ESBLs的垂直遗传传播有关。

由此可见，KP染色体DNA上携带β-内酰胺类SHV基因是其对氨苄西林、哌拉西林高度耐药的重要原因；产ESBLs肺炎克雷伯菌的克隆播散与其携带的β-内酰胺类KPC、CTX-M-9、TEM基因和喹诺酮类qnrA、acc(6′)-Ib-cr等基因有关；此外，无论病原性还是环境KP质粒均有β-内酰胺类基因，所以β-内酰胺类的SHV、CTX-M-2、KPC、TEM、IMP、CTX-M-9和喹诺酮类acc(6′)-Ib-cr等基因还与质粒水平播散有关。采取积极有效的NICU病房环境消毒灭菌方案、加强NICU接触隔离措施，减少KP的水平传播，是预防交叉感染和防控KP临床耐药性产生和传播重要措施。