林标声，严建彬，钟志龙，罗 建，周孝琼

(1. 龙岩学院；2. 易之泰生物科技(龙岩)有限公司；3. 龙岩正高生物科技有限公司；4. 福建龙岩金和动物饲料有限公司 福建龙岩 364000)

玉米芯是玉米果穗脱去子粒后的穗轴，在中国年产量巨大，达2千万吨以上[1]。目前，大部分玉米芯未得到充分的利用，主要作为燃料烧掉，一方面污染环境，另一方面又造成了资源的极大浪费。研究表明，玉米芯中包括32%～36%纤维素、35%～40%半纤维素、17%～20%木质素和少量的灰分以及其它组分，具有很高的营养价值，经加工后可用作优质粗饲料资源[2]。但实践表明，玉米芯中主要营养成分纤维素、半纤维素和复杂多糖等在畜体内难以消化，实际饲喂的效果并不理想[3]。目前市场上玉米芯发酵饲料产品主要为添加复合益生菌发酵，未添加外源的酶制剂[4]或仅添加单一酶制剂发酵[5]，玉米芯中的大分子物质未得到最充分的利用。因而，本研究采用益生菌及多功能外源酶协同发酵技术以期增强玉米芯各营养物质的降解，改善适口性和消化利用率，促进畜禽生长，用以改善畜禽肠道生态平衡，增强免疫力，提高生产性能，并为玉米芯的综合利用及畜禽饲粮的配制研究提供基础依据[6]。

本研究结合微生物益生菌改善肠道健康和非淀粉多糖(Non- Starch Polysaccharide，NSP)酶对玉米芯主要营养成分具有良好降解作用的优势，制备一种玉米芯菌酶协同发酵预混饲料，通过采用响应面分析法中Plackett-Burman、Box-Behnken设计优化其发酵工艺参数，确定玉米芯菌酶协同发酵饲料最优的制备工艺条件，以期开发出一种适合育肥猪饲用的高品质混合饲料，变废为宝，延长玉米芯等农副产品废弃物料应用产业链，为其在家畜生产中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米芯：市场购买，去掉霉烂部分，60～70 ℃烘干后过50～100目筛粉碎备用。

复合菌株：根据玉米芯的营养成分及已有的玉米芯发酵饲料研究[4]，从市场购买含发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)冻干菌混合菌粉，其中发酵乳杆菌含量6.2×109～7.7×109CFU/g、酿酒酵母3.3×108～4.6×108CFU/g、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)2.5×108～4.2×108CFU/g。

NSP酶及其活力组成：木聚糖酶活性10000～20000 U/g，β-葡聚糖酶活性1000～1500 U/g，甘露聚糖酶活性200～300 U/g，纤维素酶活性2000～4000 U/g，果胶酶活性100～300 U/g。

发酵装置：选择带有单向透气孔的PE膜，5～7层厚，透气孔经9～12 mm，透氧量2.25～4.42 cm3/m2.d. bar ，排气压力678～750 mmH2O。

玉米芯发酵基础培养基(1000 g)：玉米芯670 g，红糖15 g，复合多维15 g，水300 g，另添加NSP酶0.6～0.8 g。其中，每千克复合多维包括：维生素A 4000000 IU，维生素B1 1000 mg，维生素B2 3200 mg，维生素B6 800.0 mg，维生素B12 24 mg，维生素D3 1200000 IU，维生素E 30000 IU，维生素K3 800.0 mg， D-生物素 480.0 mg，D-泛酸 14400 mg，叶酸2800 mg，烟酸24000 mg。

1.2 方法

1.2.1 试验整体工艺流程

发酵复合菌株→25～30 ℃红糖水活化

↓

发酵原料(玉米芯、复合多维、NSP酶、水等)→ 混合→单向透气孔的PE膜袋装密封→发酵→检测产品(营养成分、总菌数、外观形态等)

1.2.2 影响玉米芯菌酶协同发酵效果关键因素筛选的Plackett-Burman试验设计

在1000 g装量的发酵袋中设定的比例接入发酵原料(玉米芯、复合多维、NSP酶)、红糖水活化后的菌株，并按比例补足水分，包装、密封，在25～30 ℃下进行发酵5～8 d，待发酵物料中颜色变深明显，含有明显清香气味时，发酵结束，待检。采用响应面分析法中Plackett-Burman 试验设计，以总菌数为响应值筛选出影响发酵效果的显著因素，具体试验设计如表1所示[7]。

表1 影响玉米芯菌酶协同发酵的Plackett-Burman 试验设计的因素水平表和编码

1.2.3 影响玉米芯菌酶协同发酵效果的Box-Behnken响应面优化试验设计

按Plackett-Burman试验设计筛选对响应值影响显著的关键因素进行Box-Behnken响应面设计[8]，优化得到影响玉米芯菌酶协同发酵的最佳工艺参数，并对最佳工艺参数进行验证分析。

1.2.4 发酵饲料产品性能测定

对所优化确定的最优工艺条件制备玉米芯发酵饲料，对产品发酵前后的外观、微生物菌株含量、营养成分组成等进行分析，检测发酵效果。微生物菌株含量采用平板活菌计数法；粗蛋白、干物质、粗灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗脂肪、还原糖、钙、磷等营养成分分析均按照饲料常规分析方法测定[9]。

2 结果与分析

2.1 影响玉米芯菌酶协同发酵效果关键因素的筛选结果

对影响玉米芯菌酶协同发酵效果的各因素进行Plackett-Burman试验设计及其试验所得响应值见表2所示，各因素影响结果的分析见表3所示。结果表明：影响玉米芯菌酶协同发酵效果的因素重要性依次排序是：玉米芯(X1)﹥菌液接种量(X6)﹥NSP(X5)﹥红糖(X2)﹥水(X4)复合多维(X3)﹥发酵时间(X8)﹥发酵温度(X7)。其中，玉米芯(X1)、菌液接种量(X6)、NSP(X5)三个因素对响应值(总菌数)的影响达到了显著水平，用以选做进一步的Box-Behnken响应面优化分析。

表2 Plackett-Burman 试验设计及响应值

表3 Plackett-Burman 试验设计各因素影响重要性分析

2.2 玉米芯菌酶协同发酵的最优工艺条件优化结果

按Plackett-Burman试验设计筛选的影响玉米芯菌酶协同发酵的三个显著因素进行响应面分析法的Box-Benhnken设计，同样以总菌数为响应值，具体的实验设计及结果见表4所示。采用Design-Expert7.0 软件对索获得的响应值进行回归分析，获得响应值(总菌数)和各因素之间的二元回归方程为：Y=4.91+0.16A+0.094B+0.032C+0.02AB-0.048AC+0.052BC-0.18A2-0.15B2-0.13C2。响应值(总菌数)和各因素之间的回归模型分析见表5所示，该模型P<0.000、失拟项P=0.0708>0.05，拟合情况好，具有统计学意义，最终确定对玉米芯菌酶协同发酵影响大小依次为玉米芯(A)>菌液接种量(B)>NSP(C)，且三个因素对响应值影响均达显著水平(P<0.05)。

表4 Box-Benhnken试验设计与响应值

表5 Box-Benhnken试验设计的回归模型方差分析

影响玉米芯菌酶协同发酵的三个显著因素的响应面曲面分析如图1所示，Box-Benhnken试验设计回归模型预测的最优工艺参数及响应值为：玉米芯 691.75 g/kg、菌液接种量为质量分数2.01%、NSP 0.71 g/kg，总菌数为4.97×1010。对此工艺参数进行三次实践验证，所得实际总菌数均值为4.96×1010，与模型预测值非常接近，比Plackett-Burman 试验设计获得最高响应值4.89×1010提高了1.43%。

2.3 产品性能测定结果

最优工艺条件下所制备的玉米芯菌酶协同发酵饲料发酵前后产品的性能测定见表6所示，结果表明玉米芯经菌酶协同发酵处理后，其颜色加深，产生了明显的酒香味和乳酸味，产品色泽、手感、质地也发生了明显改善；与发酵前相比，玉米芯发酵后的粗蛋白质、钙、磷含量增加，干物质、粗灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗脂肪、还原糖含量下降，其中粗蛋白质、粗灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维四个指标差异达显著水平(P<0.05)。结果表明添加NSP酶后，大大增加了玉米芯中大分子物质利用效率，蛋白质转化效率明显提高，同时也为微生物菌株的生长提供了更多的能量，各微生物菌株数量也明显增加。

表6 玉米芯菌酶协同发酵前后产品性能的测定

3 结论与讨论

本研究通过响应面分析法中的Plackett-Burman、Box-Behnken设计优化得到了玉米芯菌酶协同发酵的最优工艺参数为玉米芯 691.75 g/kg、菌液接种量为质量分数 2.01%、NSP 0.71 g/kg。菌酶协同发酵后，玉米芯中大分子物质利用效率增加，蛋白质转化效率明显提高，产生了明显的酒香味和乳酸味，产品色泽、手感、质地也发生了明显改善，为制备发酵预混饲料，替代基础日粮中玉米、豆粕等部分能量成分提供了参考依据。

NSP是植物性饲料细胞壁的主要成分，不易被单胃动物消化利用[10]，且水溶性的非淀粉多糖(如阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖)具有高度的粘性，能使动物肠道中的食糜粘度增加，阻碍饲料营养物质与消化液接触，影响营养物质消化，降低饲料转化率和动物生产性能，而添加NSP酶可以消除或减轻NSP的不良影响[11-12]，但NSP酶在饲料发酵中的研究属于新生事物，应用还属于探索阶段[13]。本研究创新性地采用了乳酸菌、酵母菌等复合益生菌与NSP酶协同发酵技术制备玉米芯发酵饲料，增强了玉米芯各物质的降解，提高了营养价值。一方面NSP酶可以破坏玉米芯细胞壁，切割其中可溶性非淀粉多糖，促进细胞壁包裹的营养物质释放，降低肠道内容物黏度，有利于营养物质与酶的相互作用，提高了消化率。另一方面，复合益生菌也可将玉米芯中畜禽难以消化的大分子物质分解成易被动物机体消化吸收的小肽、葡萄糖、氨基酸和维生素等小分子营养物质，且益生菌生长过程中分泌的乳酸、乙醇的物质还提高了饲料的适口性，刺激了生猪采食量增加，对于改善饲料适口性、调节动物肠道健康具有积极意义[14]。总之，菌酶协同发酵技术贯穿整个发酵饲料加工生产过程，其微生物益生菌与酶解技术相结合的功能，是发酵饲料最大的技术突破点，代表将来生物饲料发展的一个重要方向[15]。