项建军，金 华，韩佳月，王亿平

（1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院肾内科，安徽 合肥 230031）

膜性肾病（membranous nephropathy，MN）目前成为全球肾小球疾病中常见病之一。在国内MN已经成为检出率占全部肾活检样本中仅次于IgA肾病的第2大高发肾小球疾病，其占全部肾活检样本的23.4%[1]。MN传统治疗为激素联合免疫抑制剂，但部分患者出现感染、股骨头坏死等严重副作用，或治疗不敏感，最终发展为终末期肾功能衰竭[2-3]。因此探寻MN的发病机制和治疗方法已成为临床难题。采用大鼠尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）是制作MN的经典模型。近年来发现，micro RNA中miR-193a在肾脏过度表达可导致肾小球损伤[4]；miR-193a表达被下调后可介导肾小球壁层上皮细胞（PECs）高表达WT1等足细胞标志蛋白，促进其向足细胞转分化[5]。中医药治疗MN具有一定的临床疗效和优势，既往研究证实参地颗粒在治疗肾小球疾病中已取得良好疗效[6-7]。本研究将进一步观察参地颗粒对C-BSA大鼠肾组织中miRNA-193a和WT-1 mRNA的干预作用，探讨其治疗MN的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用2月龄清洁级雄性SD大鼠40只，体质量（200±20）g，统一购于安徽医科大学实验动物中心（合格证号：SCXK（鲁）2019-0003），适应性喂养1周。

1.1.2 实验药物与试剂 参地颗粒：由人参、桑螵蛸、鸡内金、五味子、熟地黄、茯苓、川芎共7味中药组成，由安徽省中医院制剂中心加工（皖药制字BZ20080025），每袋颗粒剂10g，约含生药34g。缬沙坦胶囊：80 mg×7粒，北京诺华制药有限公司生产，国药准字H20040217。阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）购自北京索莱宝科技有限公司（批号：725M036）；弗氏不完全佐剂（F5506）购自Sigma公司（批号SLBL9742V）；尿白蛋白试剂盒购于武汉基因美生物科技有限公司（批号GR2019-06）；尿肌酐试剂盒购于南京建成生物科技有限公司（批号：20190622）；荧光定量PCR仪购于Thermo Scientific（型号：PIKOREAL 96）；普通PCR仪购于杭州晶格科学仪器有限公司（型号：K960）；引物由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分组 动物分组：采用单纯随机抽样方法，将40只大鼠随机分为正常组、模型组、参地颗粒组、缬沙坦组4组，每组各10只。

造模：除正常组10只外，其余30只大鼠均采用大鼠尾静脉注射C-BSA诱导肾炎模型[8]：①预免疫：取1 mL C-BSA悬浮液（按1mg C-BSA+0.5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）+0.5 mL不完全弗氏佐剂充分溶合）对造模大鼠腋下、腹股沟等多处做3次皮下致敏免疫，隔日1次，共1周。②正式免疫：第2～5周按每次16 mg/（kg·d）无菌条件下由尾静脉注射C-BSA（溶于PBS中），每周3次，共计4周。造模结束后留取造模大鼠24 h尿液，测定尿蛋白阳性提示造模成功。

1.2.2 给药方法 所有大鼠在造模结束后第1天灌胃用药，参地颗粒组予以4.0 g/（kg·d）参地颗粒水溶液，缬沙坦组予以20 mg/（kg·d）缬沙坦胶囊混悬液，正常组和模型组给予等量生理盐水。每天1次，每次3mL，连续给药8周。

1.3 标本采集及检测方法 给药8周后代谢笼收集大鼠24 h尿液，ELISA法检测尿白蛋白和尿肌酐浓度、尿Nephrin和Podocalyxin含量。2%的戊巴比妥麻醉大鼠，摘取右侧肾脏，提取总RNA，qRT-PCR法检测WT-1及miRNA-193a mRNA表达；取少许左侧肾皮质置于2%戊二醛固定液中，置于4℃冰箱保存，以备电镜检查。

qRT-PCR检测方法：取肾脏组织，液氮下研成粉末，Trizol法抽提总RNA，生物分光光度计测定RNA浓度，OD260/OD280为1.8～2.0。取1 000 ng总RNA逆转录成 cDNA，逆转条件为：37℃ 15 min，85℃ 5 s。将制备好的cDNA进行PCR扩增，反应体系为20 μL体系，反应条件如下：①预变性：95℃，60s；②变性：95℃ 20 s；③退火、延伸：60℃ 60 s，40个循环。以β-actin为内参。见表1。

表1 扩增基因的引物序列

1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0软件进行统计分析，结果以均值±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；若资料不符合正态分布或方差不齐则采用非参数检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA法检测尿白蛋白和尿肌酐浓度、尿Nephrin和Podocalyxin含量 与正常组比较，模型组大鼠的尿白蛋白/尿肌酐比值（UACR）、尿Nephrin和Podocalyxin含量均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，参地颗粒组和缬沙坦组大鼠的UACR、尿Nephrin和Podocalyxin含量均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；且参地颗粒组的UACR、尿Podocalyxin变化明显优于缬沙坦组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠UACR、尿Nephrin和Podocalyxin含量比较（±s）

表2 各组大鼠UACR、尿Nephrin和Podocalyxin含量比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05；与缬沙坦组比较，△P＜0.05。

组别 n 尿Podocalyxin/（ng·mL-1）正常组 8 10.50±5.56模型组 6 49.16±6.76*参地颗粒组 7 15.22±3.21▲△缬沙坦组 6 19.57±3.16▲UACR/（mg·g-1）0.12±0.02 0.46±0.04*0.26±0.07▲△0.31±0.06▲尿Nephrin/（ng·mL-1）15.95±3.03 52.02±4.79*21.25±1.85▲24.97±4.20▲

2.2 qRT-PCR法检测肾组织中WT-1及miRNA-193a mRNA表达 与正常组比较，模型组大鼠肾组织中miR-193a mRNA表达量下降，WT-1 mRNA表达量增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，参地颗粒组和缬沙坦组的miR-193a mRNA表达量升高，WT-1 mRNA表达量下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；且参地颗粒组的WT-1和miRNA-193a mRNA表达量变化明显优于缬沙坦组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠肾组织中WT-1及miRNA-193a mRNA表达比较（±s）

表3 各组大鼠肾组织中WT-1及miRNA-193a mRNA表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05；与缬沙坦组比较，△P＜0.05。

组别 n miRNA-193a正常组 8 1.00±0.18模型组 6 1.75±0.27*参地颗粒组 7 1.27±0.20▲△缬沙坦组 6 1.35±0.12▲WT-1 1.00±0.28 0.40±0.16*0.64±0.17▲△0.53±0.28▲

2.3 透射电镜观察 正常组大鼠的肾小球足细胞结构正常，未见足突融合，基底膜均匀且未见增厚，上皮下未见电子致密物形成（图1A）。模型组大鼠的足突可见大部分融合或消失，基底膜弥漫性增厚，上皮下可见大块电子致密物沉积（图1 B1、图1 B2）。参地颗粒组和缬沙坦组大鼠的肾小球足突融合程度较模型组减轻，基底膜轻度增厚，伴有少量电子致密物沉积（图1C、图1 D1、图1 D2）。

图1 电镜观察各组大鼠的肾小球超微结构图

计算肾小球基底膜（GBM）平均厚度（TGBM）：透射电镜在1.5万倍下随机测定连续5处GBM厚度，计算GBM平均厚度（TGBM）。与正常组比较，模型组大鼠的TGBM升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，参地颗粒组和缬沙坦组大鼠的TGBM均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；且参地颗粒组TGBM的变化优于缬沙坦组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠肾小球基底膜（GBM）平均厚度（TGBM）比较（±s）

表4 各组大鼠肾小球基底膜（GBM）平均厚度（TGBM）比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05；与缬沙坦组比较，△P＜0.05。

组别 TGBM/nm正常组 183.74±38.12模型组 690.33±274.53*参地颗粒组 224.83±61.39▲△缬沙坦组 307.10±139.49▲n 8 6 7 6

3 讨论

MN是肾病综合征最主要的病理类型之一，临床上多以大量蛋白尿为主要表现，蛋白尿持续性漏出是MN进行性进展的要素，故减少尿蛋白是治疗MN的关键。MN蛋白尿的形成与足细胞结构和功能改变有密切关系[9]。足细胞是一种分布在肾小球毛细血管基底膜外侧高度分化的内脏上皮细胞，在正常情况下，大分子蛋白等物质无法通过足细胞的足突与足突之间形成的隔膜裂孔，故足细胞被认为是构成防止血中蛋白质进入尿液的滤过屏障的最终端部分。研究已证实[10-11]，足细胞的损伤及凋亡与足细胞分子基因WT-1突变有关联，WT-1基因的正常表达对保障足细胞甚至肾小球发育起着关键作用。Wagner N[12]等通过临床研究及基因敲除研究发现，构成足细胞的两种关键蛋白nephrin及podocalyxin在肾小球滤过中至关重要，而这两种蛋白的正常表达依赖WT1基因的调控，因此，WT1基因表达的下调，影响足细胞的形态及功能，加重了蛋白尿的漏出及肾脏的病理损伤。WT1的转录是由miRNAs反向调控[13]，miRNAs是一类由20～25个核苷酸组成的非编码微小RNA，其通过参与转录来降低目标基因的表达来改变机体病理生理机制。miR-193a正是通过调控WT-1的表达来影响足细胞表型。miR-193a的靶点为WT-1基因编码区域中的一个单一结合位点，而WT-1基因是足突细胞表型的主控基因，起到负责编码调控足细胞转录因子的作用，维持着足细胞的正常生理功能[14]。JiaoLi[15]等通过检测SD大鼠肾组织中凋亡因子Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表达发现，当抑制miR-193a的表达，则Caspase-3、Bax的表达也不再上调，进一步证实了下调miR-193a的表达可以减少足细胞的凋亡。AbheepsaMishra[16]等通过抑制人类足细胞miR-193a的表达，从而引起足细胞WT1表达的上调，进一步提示了在miR-193a与WT1表达呈负性关联。因此，可以通过抑制miR-193a的上调从而维护足细胞稳定。C-BSA大鼠是制作MN的经典模型之一。本研究发现，C-BSA大鼠肾组织中miR-193a mRNA表达量上调，WT-1 mRNA表达量减少，提示miR-193a在MN的发生发展过程中可能起到一定的作用。

MN按其证候特点，中医学上属于“尿浊”“水肿”等范畴。结合历代医家对膜性肾病病机的认识及本团队长期致力于中医药治疗肾小球疾病的研究，认为脾肾亏虚、瘀阻肾络是本病的基本病机[17]，故在清朝新安医学名医程林删定的《圣济总录纂要·卷十三·虚劳门》中人参汤的基础上创立了参地颗粒。方中人参为君药，补气、补肾阳、固摄精微；五味子、桑螵蛸、鸡内金固摄精微，联合熟地黄、茯苓健脾补肾，共为臣药；川芎活血化瘀，为佐使药。全方注重补肾健脾，固摄精微之效，亦不失活血化瘀通络之功。现代药理学研究表明，参地颗粒中的人参具有增强免疫力、抗衰老、抗氧化应激等作用，人参皂苷Rg1具有维护裂孔隔膜分子的稳定的作用，促进足细胞标志蛋白nephrin的修复[18-19]，减轻足细胞损伤，减少蛋白尿，从而保护肾脏。五味子能增强WT1和nephrin的表达，进一步保护足细胞的稳定性和减少蛋白尿[20]。桑螵蛸具有改善免疫力、抗氧化、抗利尿等作用[21]。鸡内金具有抗氧化、改善血糖血脂水平和血流动力学参数、改善胃肠功能，从而改善膜性肾病高凝状态，缓解膜性肾病临床症状作用[22]。熟地能加强机体造血功能、调节机体自由基、提高机体免疫力、抑制细胞凋亡[23]。茯苓中的茯苓多糖可通过抑制炎症因子的释放，调节机体免疫、促进机体血液循环达到抗凝作用[24]。川芎具有减少尿蛋白、促进血液循环、抗血小板聚集、护肾抗炎等作用[25-26]。因而参地颗粒具有增强免疫力、抗氧化、促进血液循环，减轻肾脏病理损害等作用。本研究结果表明，参地颗粒通过抑制C-BSA大鼠肾组织中miR-193a表达，上调WT-1表达，进而减轻足细胞损伤，从而发挥降低尿蛋白作用。