黄莎 杨建伟 高炜 师怡 张和军 林锦源 吴光峰 林鹭萍

李惠

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是我国常见恶性肿瘤之一，其发病机制尚未完全明确，目前认为与多条信号传导通路有关[1]。研究发现，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路的异常激活在CRC 发生发展过程中起重要作用[2]。目前在中国人群，针对MAPK 信号传导通路上KRAS、NRAS 及BRAF 基因状态与CRC 临床病理特征之间的关系认识并不充分。本研究通过检测分析370 例CRC 患者中KRAS、NRAS 及BRAF 基因常见位点突变情况，探索上述基因与临床病理特征之间的关系，为CRC 患者的综合治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2018 年1 月—2020 年11 月在福建省肿瘤医院接受治疗的370 例CRC 患者。所有患者组织标本及临床病理资料完整。本研究已获得福建省肿瘤医学伦理委员会批准。

1.2 KRAS、NRAS 及BRAF 基因突变检测

用试剂盒DNA FFPE Tissue Kit 提取结直肠癌组织DNA，采用PCR 扩增，用直接测序法检测KRAS、NRAS 及BRAF 基因突变。

1.3 错配修复（MMR）蛋白表达检测

使用BenchMark ULTRA 全自动免疫组化仪进行MMR 蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）检测，所用试剂均为福州迈新生物技术开发有限公司生产。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 均表达为（+）判为pMMR，而MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 中任意一种表达为（-）则判为dMMR。

1.4 统计学分析

采用SPSS 25.0 版软件处理数据。采用χ2检验或Fish 精确概率法分析基因状态与临床病理特征的关系。P＜0.05 差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病例资料

370 例CRC 患者中，男性236 例，女性134 例，年龄25 ～83 岁；右半结肠癌103 例，左半结肠癌及直肠癌267 例。

2.2 KRAS、NRAS 及BRAF 基因突变频率及类型

370 例CRC 患者中，KRAS 基因突变率最高，突变患者155例（41.9%），其中第2、3、4 外显子突变例数分别为138 例（89.0%）、8 例（5.2%）、9 例（5.8%）。其中KRAS 基因第2 外显子第12 密码子突变107 例，第13 密码子突变31 例；第3 外显子第59 密码子突变2 例，第61 密码子突变6 例；第4外显子第117 密码子突变0 例，第146 密码子突变9 例。NRAS基因突变患者19 例（5.1%），其中第2、3、4 外显子突变例数分别为10 例（52.6%）、9 例（47.4%）、0 例。其中NRAS基因第2 外显子第12 密码子突变6 例，第13 密码子突变4 例；第3 外显子第59 密码子突变0 例，第61 密码子突变9 例。BRAF 基因突变患者40 例（10.8%），其中1 例患者突变类型为G469V，其他39 例均为V600E 突变。

2.3 KRAS、NRAS 及BRAF 基因突变与CRC 临床病理特征之间的关系

KRAS 基因在女性、高中分化患者中突变率高（P=0.009，P=0.007），但与患者年龄、肿瘤部位、大体类型、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、MMR 蛋白表达无关。NRAS 基因在低分化、浸润型患者中突变率高（P=0.003），但与其他临床病理因素无关。BRAF V600E 突变在右半结肠癌、年龄小于50 岁患者中的突变率高（P=0.007、P=0.004），在低分化、浸润型患者中的突变率高（P=0.000），多发生区域淋巴结转移及远处转移（P=0.047、P=0.001），但与性别、肿瘤浸润深度、MMR 蛋白表达无关。见表1。

表1 KRAS、NRAS 及BRAFV600E 突变与CRC 临床病理特征的关系[例（%）]

3 讨论

CRC 是我国常见的恶性肿瘤之一，其发生发展，是由一系列复杂的遗传和表观遗传事件逐渐累积所致。近年来，结直肠癌分型联盟将CRC 的分子分型分为CMS 1-4 型，每种亚型具有各自的分子学及临床特征[3]。但CMS 分型属于群体分型，无法指导临床治疗。因此，我们需要对每一位患者进行治疗靶点的分型，通过检测微卫星状态、MMR 蛋白、KRAS、NRAS、BRAF 等基因选择治疗策略。

临床研究表明，全RAS 野生型患者在标准化疗基础上联合表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）单抗可延长生存期[4]。KRAS 或NRAS 基因突变是EGFR 单抗原发性耐药的主要发生机制。在CRC 患者中，KRAS 突变率为40%，其中主要是第2 外显子第12、13 密码子突变[5]。本研究对KRAS 及NRAS 基因进行检测，KRAS 基因突变率为41.9%，第2 外显子突变率为37.3%，与文献报道相似。文献报道在CRC 患者中KRAS 第3 外显子突变率仅为2.1%[5]，本研究中第3 外显子突变率为2.2%。国内对于KRAS 第4 外显子突变的报道很少，本研究检测到第4 外显子突变率为2.4%，均为第146 密码子突变。有报道显示，KRAS 基因突变与年龄、性别、原发肿瘤部位、TNM 分期等临床病理特征无关[6]。本研究显示，KRAS 基因在女性患者、高中分化患者中突变率高，但与患者年龄、肿瘤部位、大体类型、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、MMR 蛋白表达无关。

研究结果显示，NRAS 基因突变率为2.6%[7]。本研究检测到NRAS 突变率为5.1%，其中第2、3 外显子突变率分别为2.7%、2.4%，未检测到第4 外显子突变。本研究显示，NRAS 基因在低分化、浸润型患者中突变率高，但NRAS 基因突变与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、MMR 蛋白表达无关。

BRAF 基因编码的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶是MAPK 信号通路中重要的转导因子。在CRC 中，BRAF 基因突变率为5% ～10%[8-9]，最常见突变位点是V600E[10]。BRAF 基因V600E 突变患者有其独特的临床病理特征，常发生在右半结肠，分化差，与高度微卫星不稳定和锯齿状腺瘤癌变途径相关[11]。同时，BRAF 基因V600E 突变是晚期结直肠癌的独立不良预后因素[12]。本研究检测BRAF 基因突变率为10.8%，其中1 例为G469V 突变，其他均为V600E 突变。BRAF 基因V600E突变与KRAS、NRAS 基因突变不同时存在，但1 例BRAF 基因G469V 突变患者同时存在NRAS G12D 突变。本研究显示，BRAF V600E 突变多发生于右半结肠癌、年龄小于50 岁、低分化、浸润型、区域淋巴结转移及远处转移的患者中。文献报道，dMMR CRC 中原发灶和转移灶分别有50%和25%的患者可检测出BRAF 基因V600E 突变[1]。但本研究显示BRAF 基因V600E突变与患者MMR 蛋白表达无关，可能与样本量较小有关。

本研究对370 例中国CRC 患者的KRAS、NRAS、BRAF 及MMR 蛋白进行了检测，收集整理了所有患者的临床资料，通过统计学分析，对基因突变状态和临床病理特征之间的关系进行研究，为了解中国CRC 患者热点基因突变分布情况和临床精准诊疗提供理论依据和重要参考。