田春花，魏景坤，马 钊，马 璞，金 秋，马鸿云

(宁夏回族自治区人民医院妇产科，宁夏银川 750002)

近年来，子宫内膜癌发病率随女性肥胖率升高而上升，并出现年轻化趋势[1]。研究表明14.0 %子宫内膜癌患者为育龄女性，其中70.0 %仍有生育要求[2]。手术治疗方案往往易导致患者丧失生育能力，还需要进一步探索研究[3-4]。为满足子宫内膜癌患者的生育愿望，左炔诺孕酮宫内缓释系统常被用作药物治疗方式，并被多个指南列为首选治疗方案[5]。目前，如何确定合适剂量的左炔诺孕酮是临床关注热点。本研究旨在对比不同剂量的左炔诺孕酮对子宫内膜癌细胞株的作用，从而确定抑制子宫内膜癌细胞的最佳局部左炔诺酮的药物剂量。

1 材料与方法

1.1材料 人类子宫内膜癌细胞系Ishikawa(BNCC338359，北纳生物)。

1.2实验试剂 左炔诺孕酮(型号：S1727，Selleckchem)：50 mg HCY干粉中加入1.6 mL DMSO溶解，得100 mM母液，-20 ℃分装保存，根据实验需求剂量进行稀释。

1.3试验方法 CCK-8(Cell Counting Kit-8)检测(KGA317凯基生物)：将子宫内膜癌细胞株消化、重悬、计数同时铺96孔板(其中细胞密度为5×103个/孔)，等待子宫内膜癌细胞贴壁后，按照实验设计剂量分组处理。处理24 h和48 h后，向待测孔加入10 μL CCK-8(KGA317，凯基生物)反应2 h，采用酶标仪(SAFIREII TECAN)在波长450 nm处测吸光值并计算细胞的存活率。流式细胞检测：(1)样品预处理。弃子宫内膜癌细胞株上清液，每孔加1 mL PBS(KGB5001凯基生物)润洗后滴加200 μL含EDTA胰蛋白酶消化液(T1300 Solarbio)，放入37℃培养箱(型号：BPN-80CM，上海一恒科学仪器有限公司)消化。(2)消化后，用含血清的完全培养基终止子宫内膜细胞消化、吹散后收集子宫内膜癌细胞悬液。将子宫内膜癌细胞悬液在2 500 rpm离心(常州中捷实验仪器制造有限公司，型号：TGL-16D)3 min并弃上清液。加1 mL PBS(KGB5001凯基生物)后再2 500 rpm离心3 min后弃去子宫内膜癌细胞上清液、每管加PBS 300 μL混匀后再加入5 μL Annexin V-FITC(AP101-100-kit，MULTI SCIENCES联科生物)和5 μL PI，轻混匀后，于室温避光孵育10 min后上机。

2 结果

2.1子宫内膜癌细胞株存活率 在人子宫内膜癌细胞株中分别加入0、1、5、10、50、100 μM左炔诺酮，药物处理后细胞培养如图1所示。通过CCK-8计算在24 h、48 h细胞存活率。结果发现随着左炔诺酮剂量增加，子宫内膜癌细胞株在24 h、48 h处理后随处理剂量增加存活率均明显下降，实验组与对照组组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)，特别是100 μM组。见表1。

表1 对照组和不同剂量左炔诺酮实验组24 h、48 h子宫内膜细胞株存活率

2.2子宫内膜癌细胞株凋亡率 通过流式细胞法分别计算24 h、48 h后不同剂量左炔诺酮实验组和对照组的子宫内膜癌细胞株凋亡率。流式细胞结果见图2。结果发现：随着左炔诺酮剂量增加，子宫内膜癌细胞株在24 h、48 h凋亡率逐渐升高，尤其是100 μM左炔诺酮组，其凋亡率分别为22.11 %、23.40 %，明显高于其他组；24 h与48 h处理后，各剂量实验组与对照组组间凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

图1 24 h(上)和48 h(下)不同剂量对照组和实验组的细胞培养图

表2 对照组和不同剂量左炔诺酮实验组24 h、48 h时子宫内膜细胞株凋亡率

图2 24 h(上)和48 h(下)不同剂量实验组的流式细胞结果图

3 讨论

子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。年轻患者子宫内膜癌确诊时大多数处于 Ⅰ 期(早期)，具有癌细胞分化程度较高(G1～G2)且极少发生肌层浸润的特点[6]。目前，临床上对于有生育要求的子宫内膜癌患者，为保留其生育功能，通常采用单独应用孕激素或/和联合宫腔镜下局部病灶切除术[7]。孕激素中疗效肯定的是LNG—IUS，因该系统每天能够恒定量的释放的左炔诺孕酮20 μg。左炔诺酮有拮抗雌激素的作用，利用左炔诺酮拮抗雌激素的作用来逆转子宫内膜细胞的增生或逆转子宫内膜癌细胞的增殖作用[8]。与所有局部用药的特点一样，左炔诺酮局部用药还可以避免口服引起的全身不良反应，如体重增加、血栓风险、肝功能异常等等[2]。但是Baker和Hubbs[9-10]等研究发现，与口服孕激素相比，左炔诺孕酮宫内缓释系统在治疗子宫内膜癌患者中表现出“低效能”，这与该系统释放的左炔诺孕酮剂量较小有关，因左炔诺酮的剂量较小未能达到最佳抑癌作用。那么究竟多大剂量的左炔若酮能很好地抑制子宫内膜癌细胞的增殖？本次实验在子宫内膜癌细胞株中加入不同剂量(0 、1、5、10、50、100 μM)的左炔诺孕酮，分别在24 h、48 h观察子宫内膜癌细胞的存活率、凋亡率，结果发现，在24 h、48 h时，子宫内膜癌细胞株在10、50和100 μM组的存活率逐渐降低、凋亡率逐渐升高，其中在0 μM左炔诺酮组在24 h、48 h细胞存活率均为100.00 %，凋亡率为10.91 %和8.95 %。随着左炔诺酮剂量的增加，存活率逐渐降低，凋亡率逐渐增加，尤其在100 μM左炔诺酮组细胞存活率在24 h、48 h分别为79.32 %、75.11 %，凋亡率22.11 %、23.40 %,差异有统计学差异。这表明左炔诺孕酮能够抑制子宫内膜癌细胞株的存活，并加速子宫内膜癌细胞株的凋亡；当左炔诺孕酮剂量大于10 μM时，随着剂量的增加，子宫内膜癌细胞株的存活率明显下降，凋亡率明显升高。虽然对直接添加左炔诺酮至子宫内膜癌细胞的研究较少，但已有临床追踪研究证明了左炔诺酮剂量对子宫内膜癌的治疗效果。田燕妮与吴海等[11-12]的研究均发现LNG-IUS对子宫内膜癌治疗的有效性。丁雪梅等[13]对不同学者的研究综述表明孕酮对子宫内膜癌的抑制作用呈浓度依赖性。D.Wildemeersch[14]研究发现,Femilis系统在初始一周释放约3倍于LNG-IUS系统释放的左炔诺孕酮时，具有较好的治疗效果，但还需进一步地探究。

综上所述，左炔诺孕酮能够降低子宫内膜癌细胞株存活率，加速子宫内膜癌细胞株凋亡，其效能与左炔诺孕酮剂量正相关性，为增加LNG—IUS日释放量用于子宫内膜癌患者保留生育功能治疗提供了线索及启示。