杜 飞， 于之涵， 马利文， 戚瑜颖

(陕西科技大学 轻工科学与工程学院 陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室 轻化工程国家级实验教学示范中心， 陕西 西安 710021)

0 引言

世界卫生组织认为，新型纸基生物传感器应具有无设备、易操作、成本低、环保、并且可以直接交付给终端用户使用的特点，尤其针对于发展中国家及资源有限地区[1-4].目前，纸芯片检测设备的生物检测稳定性较差，且无法实现工厂量化生产，检测过程需要借助仪器设备，带来了环境污染及资源浪费等一系列后续问题[5-8].

基于这一思路，本课题组在前期从纸基材自身源头角度出发，通过调整植物纤维的配比，添加木素，接枝羟基、羧基基团等微调控手段，增强了植物纤维对葡萄糖氧化酶的吸附性能，获得了具有良好物理性能的改性过后的纸芯片产品[9].本研究以微调控处理后的改性纸基材为原材料，以葡萄糖氧化酶作为生物标记物，对纸芯片的吸附稳定性和检测稳定性进行探究.

在密闭体系中引入遇氧淬灭的Ru(bpy)3Cl2·3H2O荧光指示剂，来监测体系中酶活性的变化，通过荧光光谱仪分析荧光强度值的变化，来表征葡萄糖氧化酶的活性[10-12].讨论改变储存时间、储存温度、湿度、环境pH、外来污染物等影响因素下微调控纸芯片的检测稳定性[13-15]，将各影响因素作用条件下的检测稳定性与初始葡萄糖氧化酶的瞬时吸附稳定性作对比，本文选取初始酶活性的50%为失活临界点[16,17].通过对纸芯片产品因素临界条件，进而达到既提高了纸芯片产品检测的稳定性又实现了可以流水线量化生产目的.为后期微流控纸基检测平台的设计及表面流体控制及机理研究有重要意义[18-20].

1 实验部分

1.1 实验原料

三水合三(2,2-联吡啶基)二氯钌(II)Ru(bpy)3Cl2·3H2O(98%，上海晶纯生化科技股份有限公司)；葡萄糖(AR，天津市福晨化学试剂厂)；葡萄糖氧化酶(110 U/mg，美国Sigma公司)；氯化钠(AR，天津市化学试剂三厂)；氯化钾(AR，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；磷酸二氢钾(AR，天津市大茂化学试剂厂)；磷酸氢二钾(AR，天津市大茂化学试剂厂)；食用油.

1.2 实验设备

荧光光谱仪(爱丁堡FS5，英国爱丁堡)；可调移液枪(1000 ul，Dragon)；真空冷冻干燥箱(LGJ-12，北京松源华兴科技发展有限公司)；电子天平(MC249，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；高低温湿热实验箱(RHP-150AT)；四通石英比色皿(10 m/m，宜兴市天成光学仪器有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄糖氧化酶溶液的配制

分别称取8 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH2PO4，1.44 g K2HPO4，加入去离子水，配制成1 L磷酸盐缓冲液，用氢氧化钠或磷酸溶液将缓冲液pH调节至6.5.称取10 mg葡萄糖氧化酶溶解于1 L PBS缓冲液中，配制成1 U/ml的酶溶液.存储于4 ℃下保存备用.

1.3.2 反应底物葡萄糖溶液的配制

称取1.80 g葡萄糖，溶于100 mL的磷酸盐缓冲溶液中，配制成为0.1 mol/L的标准葡萄糖溶液，用保鲜膜包裹，放置4 ℃下冷藏24 h消旋后备用.

1.3.3 (Ru(bpy)3Cl2)·3H2O荧光指示剂溶液的配制

称取0.037 4 g三水合三(2,2-联吡啶基)二氯钌(II)(Ru(bpy)3Cl2)·3H2O荧光指示剂，溶于1 L pH为6.5的PBS缓冲液中，配制成0.2 mmol/L浓度溶液，备用.

1.3.4 pH反应溶液的配制

称取 Na2HPO4·12H2O 试剂72 g加入去离子水800 mL充分溶解后定容至1 000 mL，标记为磷酸缓冲液甲液.称取NaH2PO4·2H2O 试剂33 g加入去离子水800 mL充分溶解后定容至1 000 mL，标记为磷酸缓冲液乙液.根据实验中所需样品溶液pH要求，分别用磷酸缓冲液甲液和乙液相互进行pH调节，配制成pH呈梯度样的样本溶液.

1.3.5 微调控纸芯片对葡萄糖氧化酶的瞬时吸附稳定性研究

由于葡萄糖氧化酶催化分子氧将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢导致反应体系内氧气含量下降，采用遇氧淬灭Ru(bpy)3Cl2·3H2O荧光指示剂，Wang等[21]利用荧光分光光度法研究溶解氧的消耗量来反映葡萄糖氧化酶的瞬时吸附稳定性,见图1所示.

向宽度为1 cm，容积为4 mL的四通石英比色皿中加入2 mL葡萄糖标准溶液和2 mLRu(bpy)3Cl2荧光指示剂后，立即用保鲜膜将比色皿密封，使容器内部氧气含量保持不变，测得其荧光强度为空白对照组；再加入经冷冻干燥处理后载有葡萄糖氧化酶的以阔叶木为基材的微调控手段处理过后的纸片1×1 cm2，连续监测5 min内荧光强度变化.为保证实验数据准确，每次均进行三组平行试验求其平均值.

1.3.6 各个影响因素对微调控纸芯片检测稳定性研究

(1)储存时间对葡萄糖氧化酶的吸附稳定性研究

将载有葡萄糖氧化酶的小纸片制成1×1 cm2样品若干，放置于培养皿中经冷冻干燥处理24 h后，在恒温恒湿培养箱内保存，储存条件控制为温度25 ℃，湿度50%，每隔5天监测一次葡萄糖氧化酶的活性，与前期瞬时吸附稳定性结果作对比，确定变量时间对微调控纸芯片检测稳定性的临界值.为保证实验数据准确，每次均进行三组平行试验求其平均值.

(2)储存温度对葡萄糖氧化酶的吸附稳定性研究

将载有葡萄糖氧化酶的小纸片制成1×1 cm2样品若干进行平行试验，放置于培养皿中经冷冻干燥处理24 h后，在恒温恒湿培养箱内保存，储存湿度控制为50%，温度范围为20 ℃～60 ℃，各个温度点储存时间为24 h，每隔5 ℃监测一次载酶纸片中葡萄糖氧化酶的活性，与前期瞬时吸附稳定性结果作对比，确定变量温度对微调控纸芯片检测稳定性的临界值.为保证实验数据准确，每次均进行三组平行试验求其平均值.

(3)储存湿度对葡萄糖氧化酶的吸附稳定性研究

将载有葡萄糖氧化酶的小纸片制成1×1 cm2样品若干进行平行试验，放置于培养皿中经冷冻干燥24 h后，在恒温恒湿培养箱内保存，储存温度为25 ℃，湿度范围为20%～100%，各个湿度点储存时间为24 h，每隔10%检测一次载酶纸片中葡萄糖氧化酶的活性，与前期瞬时吸附稳定性结果作对比，确定变量环境湿度对微调控纸芯片检测稳定性的临界值.为保证实验数据准确，每次均进行三组平行试验求其平均值.

(4)环境pH对葡萄糖氧化酶的吸附稳定性研究

将载有葡萄糖氧化酶的小纸片制成1×1 cm2样品若干进行平行试验，放置于培养皿中经冷冻干燥24 h后，然后将pH值为3.5～7.5的标准液分别均匀喷洒覆盖于小纸片表面，模拟自然环境中pH情况，pH值每隔0.5各单位为一个监测点.将样品保存于恒温恒湿箱内，储存温度为25 ℃，湿度为50%，各个监测点的储存时间为24 h.检测pH处理过后载酶纸片中葡萄糖氧化酶的活性，与前期瞬时吸附稳定性结果作对比，确定变量环境pH对微调控纸芯片检测稳定性的临界值.为保证实验数据准确，每次均进行三组平行试验求其平均值.

(5)模拟外界污染物对葡萄氧化酶的吸附稳定性研究

如图2所示，将载有葡萄糖氧化酶的小纸片制成1×1 cm2样品若干进行平行试验，放置于培养皿中经冷冻干燥24 h后，取食用油均匀涂覆于纸片表面，在恒温恒湿培养箱内保存24 h，储存温度为25 ℃，湿度为50%.检测油污处理过后载酶纸片中葡萄糖氧化酶的活性，与前期瞬时吸附稳定性结果作对比，确定油污对微调控纸芯片检测稳定性的影响效果.为保证实验数据准确，每次均进行三组平行试验求其平均值.

将载有葡萄糖氧化酶的小纸片制成1×1 cm2样品若干进行平行试验，放置于培养皿中经冷冻干燥24 h后，取花坛边缘干燥处5 mg尘土均匀覆盖于纸片表面，在恒温恒湿培养箱内保存24 h，储存温度为25 ℃，湿度为50%.检测尘土处理过后载酶纸片中葡萄糖氧化酶的活性与前期瞬时吸附稳定性结果作对比，确定尘土对微调控纸芯片检测稳定性的影响效果.为保证实验数据准确，每次均进行三组平行试验求其平均值.

a:对定性滤纸进行油污、尘土处理前后样品；b～g:微调控手段处理后引入氨基、添加木素、CMC、HEC、提高打浆度至50 °SR、原始打浆度及载酶阔叶木纸芯片产品进行油污、尘土处理前后样品图2 经油污与尘土处理过后的 纸芯片样品示意图

2 结果与讨论

2.1 微调控纸芯片对葡萄糖氧化酶的瞬时吸附稳定性研究

在图3中，h线为五分钟内空白对照组荧光指示剂在葡萄糖标准溶液中荧光强度的变化，g曲线为五分钟内在空白对照组溶液中加入载酶定性滤纸后的荧光强度变化曲线，a～f曲线分别为五分钟内在空白对照组溶液中加入微调控手段处理后引入氨基、添加木素、CMC、HEC、提高打浆度至50 °SR、及原始打浆度的载酶阔叶木纸芯片产品.

图3 微调控前后阔叶木纸基的 荧光强度变化曲线

结果如图4所示，未加入载酶纸芯片的空白对照组荧光强度基本保持不变，为2.2×104，变化量为0，说明密闭反应中氧气含量恒定；在空白对照组溶液中加入载酶定性滤纸后，体系内发生氧化还原反应致使氧气含量降低，荧光强度从初始2.2×104上升至5.47×104，荧光强度增加量为148%；微调控手段处理后引入氨基与添加木素的纸芯片产品的瞬时吸附稳定性最佳，荧光强度从初始2.2×104分别上升至7.47×104与7.4×104(三次平行试验结果分别为7.47×104、7.46×104、7.48×104与7.38×104、7.4×104、7.42×104)，荧光强度增加量为240%和236%，较定性滤纸分别提高了92%和88%.

a:15 °SR+PEI； b:15 °SR+lignin； c:15 °SR+CMC； d:15 °SR+HEC； e:50 °SR； f:15 °SR； g:filter paper； h:control group图4 微调控前后阔叶木纸基的荧光强度

2.2 各个影响因素对微调控纸芯片检测稳定性研究

2.2.1 储存时间对葡萄糖氧化酶的吸附稳定性研究

用1.3.6(1)方法制样，将样品经恒温恒湿箱内保存后，检测变量时间对于纸芯片对葡萄糖氧化酶吸附稳定性的影响结果如图5所示.将失活临界点的荧光强度定为初始荧光强度的50%.结果显示，添加PEI后引入氨基、添加木素、CMC、HEC、提高打浆度的微调控方法改性后的纸基、原始打浆度纸基及定性滤纸的葡萄糖氧化酶失活临界时间分别为50天、45天、45天、55天、40天、45天、40天，且添加PEI后引入氨基与HEC处理过后的纸芯片产品储存时间较长.其中，添加PEI后引入氨基的纸芯片产品在储存时间为0～20天内酶的活性相对稳定，20～45天内下降较快而后缓慢降低直至趋于稳定.

图5 微调控后阔叶木纸基随储存时间 变化的荧光强度变化曲线

2.2.2 储存温度对葡萄糖氧化酶的吸附稳定性研究

用1.3.6(2)方法制样，将样品经恒温恒湿箱内保存后，检测变量温度对于纸芯片对葡萄糖氧化酶吸附稳定性的影响结果如图6所示.将失活临界点的荧光强度定为初始荧光强度的50%.结果显示，各种微调控手段下的载酶阔叶木纸基在20 ℃～60 ℃范围内，葡萄糖氧化酶的活性均达到50%以上，其中，在35 ℃～45 ℃范围内，葡萄糖氧化酶的活性高达90%以上.游离的葡萄糖氧化酶的酶活力在25 ℃～60 ℃的范围内酶活力百分比都在50%以上，最适温度在 35℃～40 ℃左右.相比之下，固定化酶的最适温度比游离状态的酶稍高.

2.2.3 储存湿度对葡萄糖氧化酶的吸附稳定性研究

用1.3.6(3)方法制样，将样品经恒温恒湿箱内保存后，检测变量湿度对于纸芯片对葡萄糖氧化酶吸附稳定性的影响结果如图7所示.将失活临界点的荧光强度定为初始荧光强度的50%.结果显示，人类居住环境常见湿度范围即20%～100%，对葡萄糖氧化酶的活性影响波动不大，均可达到70%以上满足载酶后微调控纸芯片的在日常生活中的实际检测要求.

图6 微调控后阔叶木纸基随储存温度 变化的荧光强度变化曲线

图7 微调控后阔叶木纸基随储存湿度 变化的荧光强度变化曲线

2.2.4 环境pH对葡萄糖氧化酶的吸附稳定性研究

日常生活环境中由于可能出现酸雨、扬沙等极端情况，故将常见居住环境pH设定为5～7.5左右.用1.3.6(4)方法制样，将样品经恒温恒湿箱内保存后，检测变量pH对于纸芯片对葡萄糖氧化酶吸附稳定性影响结果如图8所示.将失活临界点的荧光强度定为初始荧光强度的50%.结果显示，在pH范围为4～7.5时，载酶纸片中葡萄糖氧化酶的活性均超过50%，满足载酶后微调控纸芯片在实际生活中的检测需求.

2.2.5 模拟外界污染物对葡萄氧化酶的吸附稳定性研究

用1.3.6(5)方法制样，其实验结果如图9所示.经PEI、添加木素等各种微调控手段处理过后的载酶纸芯片产品，在油污、尘土外来污染物涂覆后纸芯片的检测稳定性下降为污染前的85%～95%，均满足实际检测需要.其中，PEI手段微调控后载酶阔叶木纸芯片产品污染前的荧光强度为7.47×104，经油污污染后荧光强度降至6.85×104，为原始荧光强度的92%，经尘土污染后荧光强度降至6.56×104，为原始荧光强度的87.8%.微调控添加木素后阔叶木纸芯片产品污染前的荧光强度为7.4×104经油污污染后荧光强度降至6.46×104，为原始荧光强度的87.3%，经尘土污染后荧光强度降至6.58×104，为原始荧光强度的88.9%.

图8 微调控后阔叶木纸基随环境pH 变化的荧光强度变化曲线

(a)定性滤纸污染前后的荧光强度

(b)15 °SR阔叶木纸基污染前后的荧光强度

(c)50 °SR阔叶木纸基污染前后的荧光强度

(d)微调控引入氨基后阔叶木纸基污染前后的荧光强度

(e)微调控添加木素后阔叶木纸基污染前后的荧光强度

(f)HEC微调控后阔叶木纸基污染前后的荧光强度

(g)CMC微调控后阔叶木纸基污染前后的荧光强度图9 微调控手段处理后的纸芯片经 外来污染物(油污、尘土)污染后 的荧光强度变化

综上所述，自然环境的常见污染物如油污、尘土等外来污染物对各种微调控手段处理过后的载酶纸片的吸附稳定性影响不大，基本满足纸芯片在日常生活中的检测要求.

3 结论

本论文通过对阔叶木纸基材进行添加木素、CMC等微调控手段处理后的纸基材进行对于葡萄糖氧化酶的吸附稳定性研究，选定Ru(bpy)3Cl2·3H2O荧光指示剂，采用荧光分光光度法重点探究了储存时间、储存温度湿度环境pH值外来污染物等影响因素对葡萄糖氧化酶的吸附稳定性影响，将实验结果与初始荧光强度值作对比，确定葡萄糖氧化酶失活时各影响因素的临界范围.

微调控纸芯片对葡萄糖氧化酶的瞬时吸附稳定性表明，PEI及木素两种微调控手段处理下的阔叶木纸基对提高葡萄糖氧化酶的瞬时吸附稳定性较好，荧光强度的增加量分别为240%和236%，较定性滤纸分别增加了92%和88%.

外界条件对纸芯片酶稳定性实验结果表明，各个微调控手段处理后的纸芯片产品在环境条件为25 ℃，湿度为50%时的储存时间分别为20 ℃～60 ℃；环境湿度适用范围为20%～100%；环境pH适用范围为4～7.5；外来污染物(油污、尘土)等对载酶纸芯片的酶活性影响较小，且各种微调控手段中，添加氨基及木素的微调控手段在各个影响因素干预下生物酶稳定性均表现较好.该研究可以有针对性的为下一步微调控纸芯片的设计及流体控制及机理研究提供理论参考.