程阔菊，吴 庆，罗健华，魏谭军，周殿儒，肖 成,黄 河，罗 云，王 毅

carabin是2007年在人T细胞中发现的一个新的钙调磷酸酶(calcineurin，CaN)结合蛋白，主要表达于脾脏及血液中[1]，同时可与Ras结合，基于其与CaN和Ras均能相互作用的特性，将其命名为carabin[1]。前期研究[1-4]表明，carabin作为CaN的内源性负反馈抑制蛋白，通过CaN和Ras信号通路负反馈抑制T细胞及B细胞的持续活化，在机体免疫中发挥着重要作用。最近研究[5-6]表明，carabin在心肌细胞中亦有表达，可通过负性调节CaN和Ras信号通路抑制心肌细胞的肥大，并有可能成为诊治心衰引起心肌肥厚的靶点。我们的前期研究[7]发现，carabin在小鼠梗死心脏及经缺血/缺氧处理的人心室肌细胞株AC16中表达均显著下调，提示carabin在心肌梗死及缺血中可能起到一定的作用，但目前尚无相关研究报道。本研究拟采用腺病毒载体系统，设计针对大鼠carabin基因的干扰序列，构建carabin腺病毒干扰载体(Ad-carabin-shRNA)，感染H9C2心肌细胞筛选针对大鼠carabin基因干扰效果最佳的Ad-carabin-shRNA，为进一步观察carabin信号通路在心肌梗死及缺血中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及载体质粒 细胞株293A、293T及H9C2购自中国科学院细胞库，ADV4-U6-CMV重组穿梭质粒和pGp-Ad-pac载体骨架质粒购自吉玛基因。

1.1.2 主要试剂与仪器 RNA引物合成及DNA测序(美国，Invitrogen公司)。限制性内切酶EcoRI(NEB，R0101M)、BamHⅠ(NEB，R0136S)，T4 DNA连接酶(NEB，M0202L)，RNAi-Mate转染试剂(吉玛基因，G04001)，Polybrene(Sigma，H9268)、carabin抗体(Abcam，ab77625)、β-actin抗体(Abcam，ab115777)、山羊抗兔IgG(碧云天，WSA0208)。二氧化碳培养箱(SANYO，MCO-15AC)，生物安全柜(上海上净净化设备有限公司，BSC-ⅡA2)，荧光显微镜(Motic，AE31-252B)。

1.1.3 引物设计及合成 针对大鼠carabin基因，设计3对carabin-shRNA寡核苷酸序列(carabin-shRNA-1：5′-GAC CTT ACA CTG GGA GAA GAC-3′；carabin-shRNA-2：5′-GTC TAC CTC CCT GGC TAC TAT-3′；carabin-shRNA-3：5′- AGC TGC AGG AAG AGG TCT TCA -3′)，分别插入ADV4-U6-CMV穿梭质粒的EcoRⅠ与BamHⅠ酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成3对寡核苷酸，规格为2A。……