林明辉　朱华平　苏换换　樊佳佳　池金泉　马冬梅

摘要：【目的】分析3個尖塘鳢引进群体繁育后代的遗传多样性和遗传结构，为尖塘鳢亲本管理和资源可持续利用提供基础资料，同时为尖塘鳢的遗传改良及新品种培育打下基础。【方法】采用微卫星分子标记分析2000年引进的线纹尖塘鳢群体繁育后代（AZ1）、2005年引进的线纹尖塘鳢群体繁育后代（AZ2）及1986年引进的云斑尖塘鳢群体繁育后代（TG）的遗传多样性，运用PopGene32、CERVUS 3.0、Arlequin 3.1计算3个尖塘鳢群体的等位基因数（Na）、期望杂合度（He）、多态信息含量（PIC）及遗传分化系数（Fst）等遗传参数，基于Nei氏遗传距离利用MEGA 7.0中的非加权组平均法（UPGMA）构建系统发育进化树，并以Structure 2.3分析群体间的遗传结构。【结果】12个微卫星分子标记在 3个尖塘鳢群体中扩增得到32个等位基因。AZ1群体、AZ2群体和TG群体的平均Na分别为1.33、1.92和2.33，平均He分别为0.034、0.180和0.214，平均PIC分别为0.031、0.155和0.191。3个尖塘鳢群体间的Fst为0.077～0.384、遗传相似度为0.926～0.950、遗传距离为0.052～0.077。3个尖塘鳢群体有22.54%的变异来自于群体间，77.46%的遗传变异来自群体内。基于Nei氏遗传距离构建的UPGM系统发育进化树显示，AZ1群体和AZ2群体先聚类为一支，然后与TG群体聚类在一起。【结论】3个尖塘鳢引进群体繁殖后代遗传多样性水平较低，尤其是AZ1群体近交程度较高，因此相关引种单位或繁殖场需尽快采取相应的选育手段提高现有杂交鳢群体遗传多样性，避免近交衰退带来的风险，也可通过引进新的种质资源提高杂交鳢遗传多样性。此外，3个杂交鳢群体尚未出现种质混杂和杂交情况，仍可作为杂交鳢遗传育种奠基种群。

关键词： 云斑尖塘鳢;线纹尖塘鳢;微卫星分子标记;遗传多样性;遗传结构

中图分类号： S965.199                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）01-0213-08

Abstract：【Objective】The genetic diversity and genetic structure of offspring stocks of three imported Oxyeleotris populations in Guangdong were analyzed， in order to provide basic data for the management of the parent fish and the sustainable utilization of the Oxyeleotris resources， and to lay the foundation for genetic improvement and new variety bree-ding of Oxyeleotris. 【Method】Microsatellite markers were used to analyze the 90 offspring samples from the imported O. lineolatus populations AZ1 and AZ2 （introduced in 2000 and 2005 respectively） and the imported O. marmoratus population in 1986 （TG）. The genetic parameters， including number of alleles （Na）， expected heterozygosity （He）， polymorphism information content （PIC） and genetic differentiation coefficient （Fst） of the three populations were calculated by PopGene32， CERVUS 3.0 and Arlequin 3.1 software. The phylogenetic tree was constructed by UPGMA of Mega 7.0 program based on Neis genetic distance， and the genetic structure was calculated by Structure 2.3 software. 【Result】The results showed that a total of 32 alleles were identified in the three populations by using of 12 microsatellite markers. The number of average Na of the offspring samples for AZ1， AZ2 and TG populations were 1.33， 1.92， and 2.33 respectively; average He values were 0.034， 0.180， and 0.214; and average PIC were 0.031， 0.155， and 0.191， respectively. The Fst values ranged from 0.077 to 0.384， the genetic similarity values ranged from 0.926 to 0.950， and the genetic distance （Da） values ranged from 0.052 to 0.077. AMOVA analysis of the genetic variation revealed that only 22.54% of the genetic variation came from the inter-populations， and 77.46% genetic variation was from intra-populations among the three populations. UPGMA phylogenetic analysis based on Neis genetic distance showed that AZ1 and AZ2 populations first clustered together， and then clustered with TG population. 【Conclusion】The results indicate that the genetic diversity of the offspring stocks of three imported Oxyeleotris populations is low， and the inbreeding degree of AZ1 population is the high. It is urgent to carry out genetic improvement of Oxyeleotris as soon as possible and increase the number of parents by imported Oxyeleotris from different sources to increase the genetic diversity of the culture populations and avoid inbreeding decline risks. In addition， the three hybrid populations have not been mixed and hybridized， and can still be used as the foundation population of hybrid breeding.

Key words： Oxyeleotris marmoratus; Oxyeleotris lineolatus; microsatellite markers; genetic diversity; genetic structure

Foundation item： Guangdong Special Project for Promoting Economic Development（[]Modern Fishery Development Purpose）（Yuenong 2019B6）; Guangdong Science and Technology Plan Project （2017A040403008）; National Freshwater Germplasm Resource Center Construction Project （NFGR-2020）

0 引言

【研究意义】线纹尖塘鳢（Oxyeleotris lineolatus）和云斑尖塘鳢（O. marmoratus）隶属于鲈形目（Percifomes）鰕虎鱼亚目（Gobioidei）塘鳢科（Eletridae）尖塘鳢属（Oxyeleotris），均为我国引进的名特优淡水养殖鱼类。线纹尖塘鳢又称澳洲笋壳鱼，英文名为Sleepy cod，是澳大利亚特有的经济鱼类，我国分别于2000和2005年从原产地进行引种并繁育成功（莫介化等，2006;张邦杰等，2006）。云斑尖塘鳢俗称泰国笋壳鱼，英文名为Marble goby，原产地为泰国、越南等东南亚国家，于1986年引入我国并繁育成功（Zhao et al.，2017）。尖塘鳢因肉质白嫩爽脆、味道鲜美，而深受消费者青睐，在我国广东、海南等地已呈规模化养殖，但由于线纹尖塘鳢和云斑尖塘鳢并非我国本土鱼类，当前用于繁殖的亲本均为引进奠基种群的繁殖后代，长期传代极易导致近亲繁殖，导致群体繁殖力下降、遗传力减弱、抗病性和抗逆性降低等。为了确保证尖塘鳢养殖业的持续健康发展，非常有必要了解尖塘鳢资源现状及不同引进群体的遗传背景。【前人研究进展】目前，关于尖塘鳢的研究主要集中在形态生物学与核型分析（朱新平等，2003;张邦杰等，2004;陈永乐等，2006;Liu et al.，2019）、人工繁育与养殖技术（梁仁杰等，2004;郭建谊等，2014;Loo et al.，2015;Teoh et al.，2018）及机体免疫与病害防控（Wang et al.，2011;张新林等，2018;Guo et al.，2020）等方面。针对尖塘鳢的分子遗传学研究，李春枝等（2006）基于线粒体12S rRNA序列分析线纹尖塘鳢、云斑尖塘鳢和海丰沙塘鳢系统发育关系，结果发现线纹尖塘鳢和云斑尖塘鳢均为单系类群，二者为亲缘关系最密切的姐妹群，同时进一步证实线粒体12S rRNA序列可作为塘鳢科鱼类种类鉴定的理想分子标记;范小勇等（2009）利用RAPD分析云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢及其杂交子一代（F1）的遗传关系，结果显示F1代所接受的双亲遗传物质并非完全对等，其获得的遗传信息可能更多来自母本;王茜等（2009）基于线粒体16S rRNA序列分析6种塘鳢科鱼类的系统发育关系，结果显示线纹尖塘鳢与云斑尖塘鳢的亲缘关系最近，而尖塘鳢属与塘鳢属鱼类的同源性不高，验证了传统分类学将尖塘鳢独立成属的科学性;朱晓平等（2012）采用20对微卫星引物对线纹尖塘鳢（♀）、云斑尖塘鳢（♂）及其杂交、回交子代的遗传变异进行分析，结果表明无论是杂交还是回交均表现出一定的母本效应;陈海港等（2016）基于线粒体COⅠ基因序列建立了鉴别云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢的分子标记;Zhao等（2017）基于线粒体DNA和微卫星分析云斑尖塘鳢的遗传多样性，结果显示，在我国广东和海南养殖的云斑尖塘鳢群体为中度多态性，与引进群体相比其多态性有所下降。【本研究切入点】生物遗传多样性分析是评价物种资源状况的重要指标，也是动物遗传育种研究的基础，可为研究者提供重要的种质资源信息。因此，高效开展线纹尖塘鳢和云斑尖塘鱧的选择育种研究之前，亟待对其引进群体繁育后代进行遗传多样性分析。【拟解决的关键问题】利用微卫星分子标记对3个尖塘鳢引进群体繁育后代进行遗传多样性分析，以期为尖塘鳢亲本管理和资源可持续利用提供基础资料，同时为尖塘鳢的遗传改良及新品种培育打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

共采集90尾尖塘鳢样品，包括2000年从澳大利亚引进的线纹尖塘鳢繁殖后代（AZ1）、2005年从澳大利亚引进的线纹尖塘鳢繁殖后代（AZ2）及1986年从泰国引进的云斑尖塘鳢繁殖后代（TG），各30尾。3个尖塘鳢引进群体繁殖后代样品均采自广州锐沣渔业发展有限公司保种基地，所有样品均剪取尾鳍置于无水乙醇中，-20 ℃保存，用于基因组DNA提取。

1. 2 基因组DNA提取

采用动物组织基因组DNA提取试剂盒（广州美基生物科技有限公司）提取尖塘醴尾鳍基因组DNA，利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和完整性，并以紫外分光光度计（AG22331型，美国Eppendorf公司）检测其纯度和浓度，-20 ℃保存备用。

1. 3 PCR扩增

从已公开发表的尖塘鳢微卫星分子标记（范小勇等，2009;朱晓平等，2012）中挑选12对具有多态性、扩增条带清晰的微卫星引物（表1），用于尖塘鳢引进群体繁育后代遗传多样性分析。所有引物均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系20.0 μL：PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（TaKaRa）（1.25 U/μL）0.4 μL，5×PrimeSTAR GXL Bu-ffer（Mg2+ Plus）4.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.4 μL，基因组DNA 20 ng，ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s，各引物对应的退火温度退火30 s，72 ℃ 30 s，进行25个循环;72 ℃延伸5 min。

1. 4 扩增产物检测

PCR扩增产物采用8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，PCR扩增产物上样量均为3.0 ?L（样品与Buffer按3∶1混合），DNA Marker（50～500 bp）上样量为0.5 ?L。电泳结束后，参照许绍斌等（2002）的方法进行硝酸银染色。

1. 5 统计分析

根据每个个体产生的条带位置确定其基因型，运用PopGene32计算3个尖塘鳢群体的等位基因数（Na）和期望杂合度（He）;基于Nei氏遗传距离利用MEGA 7.0中的非加权组平均法（UPGMA）构建系统发育进化树（Kuma et al.，2016）;采用CERVUS 3.0计算多态信息含量（PIC）（Kalinowski et al.，2007）;使用Arlequin 3.1计算群体间的遗传分化系数（Fst）及进行群体分子方差分析（AMOVA）（Excoffier and Lischer，2010;孙成飞等，2015）;并以Structure 2.3分析群体间的遗传结构（Almohammed and Hadi，2019）。

2 结果与分析

2. 1 尖塘鳢群体遗传多样性分析结果

以12对微卫星引物对3个尖塘鳢群体进行PCR扩增，均获得清晰的目的条带，圖1为H113引物在3个尖塘鳢群体中的部分扩增电泳结果。

由表2可知，12对微卫星引物在3个尖塘鳢群体中扩增得到32个等位基因。AZ1群体、AZ2群体和TG群体的平均Na分别为1.33、1.92和2.33个，平均He分别为0.034、0.180和0.214，平均PIC分别为0.031、0.155和0.191。根据PIC的判断标准（PIC>0.50时为高度多态性，0.25

2. 2 尖塘鳢群体间的遗传分化

利用Arlequin 3.1计算3个尖塘鳢群体间的Fst，结果显示，AZ1群体与TG群体间的Fst最大（0.384），其次是AZ2群体与TG群体间的Fst（0.159），AZ1群体与AZ2群体间的Fst最小（0.077），即3个尖塘鳢群体间呈中度或高度分化。对3个尖塘鳢群体进行AMOVA分析，结果显示，有22.54%的遗传变异来自群体间，77.46%的遗传变异来自群体内（表3）。

2. 3 尖塘鳢群体间的遗传距离及聚类分析结果

依据Nei的方法计算3个尖塘鳢群体间的遗传相似度和遗传距离，结果如表4所示。3个尖塘鳢群体间的遗传相似度为0.926～0.950，遗传距离为0.052～0.077，表明3个尖塘鳢群体间的遗传距离较近。根据Nei氏遗传距离构建的UPGMA系统发育进化树显示，AZ1群体与AZ2群体先聚类为一支，然后与TG群体聚类在一起（图2）。根据 90尾尖塘鳢个体间的遗传距离构建UPGMA系统发育进化树，结果发现3个尖塘鳢群体90尾尖塘鳢个体中基本表现为相同群体样本聚在一起，但也有部分样本呈镶嵌式排列（图3）。

2. 4 尖塘鳢群体间的遗传结构分析结果

根据Structure 2.3执行假设K（1～7），当K=3时，对数似然函数值lnP（D）出现峰值（图4），因此将所有分析个体分为3个理论群（图5-A），即每个尖塘鳢群体单独分为1个理论群，但由于AZ1群体和AZ2群体同属于线纹尖塘鳢，而TG群体属于云斑尖塘鳢，故绘制K=2的遗传结构图进行分析（图5-B）。当K=2时，可将3个尖塘鳢群体分2个亚群，其中AZ1群体、AZ2群体和TG群体分别有91.6%、44.9%和21.3%隶属于亚群Ⅰ，而剩余的8.4%、55.1%和78.7%隶属于亚群Ⅱ。当K=3时，可将3个尖塘鳢群体分成3个亚群，其中AZ1群体、AZ2群体和TG群体分别有91.6%、24.9%和18.5%隶属于亚群Ⅰ，2.3%、69.3%和10.9%隶属于亚群Ⅱ，6.1%、5.9%和70.7%隶属于亚群Ⅲ。

3 讨论

群体遗传多样性是评价物种资源状况的重要指标，遗传多样性降低说明种群的适应力和生存力下降，尤其是近亲繁殖造成的遗传变异水平下降会降低物种繁殖力和存活率，甚至增加灭绝风险（Souza-Shibatta et al.，2018）。Na、He和PIC等是衡量人工养殖群体遗传多样性的重要指标，其数值越大，表明群体遗传多样性越高（何金钊等，2017;张永德等，2020）。本研究选用12个微卫星分子标记对3个尖塘鳢群体的遗传多样性进行监测，结果显示，每个微卫星分子标记在每个尖塘鳢群体中扩增的Na为1～5个，均低于范小勇等（2009）、朱晓平等（2012）采用相同分子标记在线纹尖塘鳢和云斑尖塘鳢群体所扩增获得的参数值。尤其是在AZ1群体中，12个微卫星分子标记有8个单态位点，其平均He为0.034，平均PIC为0.031，表明AZ1群体杂合度较低，尚处于低度多态水平（PIC<0.25）。这可能是由于奠基种群数量少，群体经多代近交繁育，其群体已达高度纯合水平。因近交种遗传稳定，故AZ1群体可作为理想的遗传育种材料。相对于AZ1群体，AZ2群体和TG群体的Na相对较高些，其中，AZ2群体有4个单态位点，TG群体有3个单态位点，其平均He分别为0.180和0.214，平均PIC分别为0.155和0.191，说明这2个尖塘鳢群体同样属于低度多态性，且近交水平较高。

Wright（1978）认为，Fst低于0.05时属于低度遗传分化，处于0.05～0.15之间属于中度遗传分化，高于0.15时属于高度遗传分化。本研究中，AZ1群体和AZ2群体均属于线纹尖塘鳢，其Fst为0.077，属于中度遗传分化;而TG群体与AZ1群体、AZ2群体的Fst分别为0.384和0.159，均属于高度遗传分化，与TG群体属于云斑尖塘鳢，AZ1群体和AZ2群体属于线纹尖塘鳢相符。说明这3个尖塘鳢引进种引入我国后在养殖过程中尚未发生种质混杂。利用Structure 2.3分析3个尖塘鳢群体的遗传结构，发现3个尖塘鳢群体独立成群。若3个尖塘鳢群体分成2个亚群时，其分析结果显示AZ1群体和TG群体相互独立，但AZ2群体中有44.9%与AZ1群体隶属于同一亚群，有55.1%与TG群体隶属于同一亚群。

孙成飞，叶星，董浚键，田园园，梁健辉. 2015. 罗氏沼虾6个养殖群体遗传多样性的微卫星分析[J]. 南方水产科学，11（2）：20-26. [Sun C F，Ye X，Dong J J，Tian Y Y，Liang J H. 2015. Genetic diversity analysis of six cultured populations of Macrobrachium rosenbergii using microsate-llite markers[J]. South China Fisheries Science，11（2）：20-26.]

王茜，齊兴柱，骆剑，范小勇，王小刚，尹绍武，陈国华，吴光明. 2009. 尖塘鳢属鱼类线粒体16S rRNA基因序列变异及分子系统进化[J]. 海南大学学报（自然科学版），27（3）：245-251. [Wang Q，Qi X Z，Luo J，Fan X Y，Wang X G，Yin S W，Chen G H，Wu G M. 2009. Sequences variation and molecular phylogeny of mitochondrial 16s rRNA gene of the genus Oxyleotris[J]. Natural Science Journal of Hainan University，27（3）：245-251.]

许绍斌，陶玉芬，杨昭庆，褚嘉祐.2002. 简单快速的DNA银染和胶保存方法[J].遗传，24（3）：335-336. [Xu S B，Tao Y F，Yang Z Q，Chu J D. 2002. A simple and rapid methods used for silver staining and gel preservation[J]. Hereditas（Beijing），24（3）：335-336.]

张邦杰，李春枝，陆昌胜，莫介化，李本旺，张瑞瑜，梁仁杰，黄永强. 2006. 池养线纹尖塘鳢的生殖及全人工繁殖[J]. 经济动物学报，10（4）：223-233. [Zhang B J，Li C Z，Lu C S，Mo J H，Li B W，Zhang R Y，Liang R J，Huang Y Q. 2006. Reproduction and artificial propagation of pond cultured Oxyeleotris lineolatus[J]. Journal of Economic Animal，10（4）：223-233.]

张邦杰，梁仁杰，张瑞瑜，李本旺，莫介化，李春枝，黄永强. 2004. 尖塘鳢（笋壳鱼）的生物学及养殖概况[J]. 淡水渔业，36（6）：58-61. [Zhang B J，Liang R J，Zhang R Y，Li B W，Mo J H，Li C Z，Huang Y Q. 2004. Biology and culture situation of Oxyeleotris marmoratus Bleeker[J]. Freshwater Fisheries，36（6）：58-61.]

张新林，戚瑞荣，唐绍林. 2018. 笋壳鱼两种病毒病的临床诊断方法[J]. 科学养鱼，（4）：67-68. [Zhang X L，Qi R R，Tang S L. 2018. Clinical diagnosis of two viral diseases in Oxyeleotris marmoratus Bleeker[J]. Scientific Fish Far-ming，（4）：67-68.]

张永德，文露婷，罗洪林，林勇，杜雪松，余艳玲，韦孜娜，黄姻. 2020. 卵形鲳鲹基因组调研及其SSR分子标记的开发应用[J]. 南方农业学报，51（5）：983-994. [Zhang Y D，Wen L T，Luo H L，Lin Y，Du X S，Yu Y L，Wei Z N，Huang Y. 2020. Genome survey and development of SSR molecular markers for Trachinotus ovatus[J]. Journal of Southern Agriculture，51（5）：983-994.]

朱晓平，骆剑，尹绍武，胡亚丽，胡静，祝斐. 2012. 线纹尖塘鳢（♀）、云斑尖塘鳢（♂）及其杂交、回交子代遗传变异的微卫星分析[J]. 中国农学通报，28（17）：147-153. [Zhu X P，Luo J，Yin S W，Hu Y L，Hu J，Zhu F. 2012. Microsa-tellite marker analysis of genetic variation in hybrid pro-genies and backcross progenies from Oxyeleotris lineolatus（♀） and Oxyeleotris marmoratus（♂）[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，28（17）：147-153.]

朱新平，刘毅辉，陈永乐，韦其锋，张双. 2003. 尖塘鳢的形态生物学与细胞核型[J]. 中国水产科学，10（1）：87-88. [Zhu X P，Liu Y H，Chen Y L，Wei Q F，Zhang S. 2003. Morphological characters and karyotype of Oxyeleotris marmoratus Bleeker[J]. Journal of Fishery Sciences of China，10（1）：87-88.]

Almohammed E，Hadi S. 2019. Analysis of 55 kidd ancestry SNPs in qatari population using ForenSeq Universal software & STRUCTURE software[J]. Forensic Science International：Genetics Supplement Series，7（1）：889-891.

Excoffier L，Lischer H E L. 2010. Arlequin suitever 3.5：A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows[J]. Molecular Ecology Resources，10（3）：564-567.

Guo X X，Zhou Y，Fu X Z，Lin Q，Liu L H，Liang H R，Niu Y J，Li N Q. 2020. Transcriptomic profiles reveal that ina-ctivated iridovirus and rhabdovirus bivalent vaccine eli-cits robust adaptive immune responses against lethal cha-llenge in marbled sleepy goby[J]. Fish & Shellfish Immunology，98：429-437.

Kalinowski T，Taper M L，Marshall T C. 2007. Revising how the computer program cervus accommodates genotyping error increases success in paternity assignment[J]. Mole-cular Ecology，16（5）：1099-1106.

Kumar S，Stecher G，Tamura K. 2016. MEGA7：Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution，33（7）：1870-1874.

Souza-Shibatta L，Kotelok-Diniz T，Ferreira D G，Shibatta O A，Sofia S H，de Assumpc?o L，Pini S F R，Makrakis S，Makrakis M C. 2018. Genetic diversity of the endangered neotropical cichlid fish（Gymnogeophagus setequedas） in Brazil[J]. Frontiers in Genetics，9：13. doi：10.3389/fgene.2018.00013.

Liu W，Zhang H，Xiang Y X，Jia K T，Luo M F，Yi M S. 2019. Molecular characterization of vasa homologue in marbled goby，Oxyeleotris marmorata：Transcription and localization analysis during gametogenesis and embryogenesis[J]. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B：Biochemistry and Molecular Biology，229：42-50.

Loo P L，Chong V C，Ibrahim S，Sabaratnam V. 2015. Mani-pulating culture conditions and feed quality to increase the survival of larval marble goby Oxyeleotris marmorata[J]. North American Journal of Aquaculture，77（2）：149-159.

Teoh C F，Lim L S，Kawamura G. 2018. Remarkably high ingestion ratio of acidic food in juvenile marble goby，Oxye-leotris marmorata[J]. International Aquatic Research，10：95-100.

Wang Q，Zeng W W，Li K B，Chang O Q，Liu C，Wu G H，Shi C B，Wu S Q. 2011. Outbreaks of an iridovirus in marbled sleepy goby，Oxyeleotris marmoratus（Bleeker），cultured in southern China[J]. Journal of Fish Diseases，34（5）：399-402.

Wright J M，Bentzen P. 1994. Microsatellites：Genetic markers for the future[J]. Reviews in Fish Biology and Fisheries，4（3）：384-388.

Wright S. 1978. Evolution and the genetics of population，vo-lume 4：Variability within and among natural populations[M]. Chicago：University of Chicago Press.

Zhao C，Zhu X P，Gu Y C，Wang Q T，Li Z C，Yin S W. 2017. Population genetic diversity of marble goby（Oxyeleotris marmoratus） inferred from mitochondrial DNA and microsatellite analysis[J]. Journal of Genetics，96（6）：e65-e71.

（責任编辑 兰宗宝）