沈萍，李雯，赵燕

(南昌市第九医院，江西 南昌 330002)

近几年，随着人们饮食和生活习惯的改变，非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发病率迅速上升，目前已成为全球最主要的慢性肝病。其中，亚洲国家患病率约为27%，欧美等西方发达国家普通成人患病率为20%～33%，且患者呈年轻化趋势[1-2]。目前仍然没有针对非酒精性脂肪肝的标准化治疗手段，尽管如此，纠正肝脏的脂代谢紊乱仍然是预防和治疗非酒精性脂肪肝的一个重要策略。当肝脏内脂质代谢紊乱时，过多堆积的脂肪就会导致脂肪肝。研究表明[3-4]，饱和脂肪酸具有导致脂质毒性的作用。棕榈酸(PA)是人类血液中含量最高的一种饱和脂肪酸，其在正常范围内可发挥相应的生理功能，但是在一些特定的病理条件下，组织内的棕榈酸异常增加，会打破组织内的稳态，增加脂毒性，导致相关疾病的发生。目前已知相关的疾病有高脂血症、肥胖型心肌病、糖尿病以及肿瘤等[5-6]。吴茱萸次碱(Rut)是芸香科植物吴茱萸中的一种重要生物活性碱，在传统中医药中广泛使用[7]，除具有抗炎、抑制癌基因、抗缺血等药理学效应外，还有抑制血小板聚集的心血管保护作用[8]。本研究从细胞层面上观察吴茱萸次碱对脂质损伤肝细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

脂质损伤肝细胞(LO2)细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 主要药品与试剂

杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)和胎牛血清购自以色列Biological Industries公司；棕榈酸钠和荧光素钠购自上海阿拉丁公司；吴茱萸次碱标准品(纯度≥98%)、BSA-无脂肪酸(d-BSA)、4%组织细胞固定液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(0.45 μm)、TC处理12孔板用细胞爬片、二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)活性氧(ROS)荧光探针均购自北京索莱宝科技有限公司；细胞增殖及毒性检测(CCK-8)试剂盒购自美国US Everbright Inc.公司；缝隙连接蛋白32(Cx32)抗体、缝隙连接蛋白26(Cx26)抗体、β-肌动蛋白(β-actin)抗体、过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔免疫球蛋白(IgG)、HRP标记山羊抗鼠IgG均购自博士德生物工程有限公司；化学发光(ECL)试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LO2细胞培养

用含10%胎牛血清(FBS)和1%青/链霉素的高糖培养基培养细胞，放置于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中培养，待细胞生长至80%～90%时，用0.25%EDTA胰酶进行消化传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.3.2 棕榈酸和吴茱萸次碱溶液的配制

1.3.2.1 棕榈酸溶液的配置

称取33 mg棕榈酸钠粉末加入3 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中，置于70 ℃水浴皂化约30 min。得到40 mmol/L棕榈酸钠皂化液，迅速加入至配制好的40% d-BSA溶液中，得到20 mmol/L PA溶液。适当摇匀，置于50 ℃水浴助溶30 min。室温冷却后观察性状，呈棕黄色澄清样，性状稳定。将PA存储液于超净台中用0.22 μm无菌滤器过滤除菌，每管1 mL冻存于-20 ℃冰柜中。

1.3.2.2 吴茱萸次碱溶液的配置

称取10 mg吴茱萸次碱标准品粉末，溶解于10 mL甲醇中，得到3.48 mmol/L Rut溶液，将Rut存储液于超净台中用0.22 μm无菌滤器过滤除菌，每管1 mL冻存于-20 ℃冰柜中。

1.3.3 CCK-8实验检测细胞活力

细胞接种于96孔板，每组6个平行孔，CO2培养箱中培养过夜；向孔内加入不同浓度的Rut(0.1 μmol/L，0.3 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L)溶液，培养箱内孵育20 min，再向每个孔中加入最佳浓度的PA溶液，干预24 h后弃培养基。每孔加入100 μL CCK-8工作液(CCK-8母液∶DMEM高糖基础培养基=1∶10)，培养箱内孵育1 h，于450 nm处测定吸光度。

1.3.4 荧光检测LO2细胞内活性氧的变化情况

取一块12 孔板，每孔均放入TC处理12孔板用细胞爬片，然后每孔加入LO2细胞悬液，干预方式同前。干预结束后倒掉培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍；加入4%多聚甲醛37 ℃固定30 min；PBS洗3遍，每孔加入1 mL含DCFH-DA荧光探针的工作液(5 μmol/L)作用60 min，终止探针作用时，用PBS清洗细胞2次，取出细胞爬片置于载玻片，用明胶封片后在荧光显微镜下观察并拍照。

1.3.5 划痕负载实验检测LO2细胞缝隙连接细胞间通讯的功能

利用荧光黄作为细胞内荧光指示探针，可观察细胞间的交流。取一块12 孔板，每孔均放入TC处理12孔板用细胞爬片，然后每孔加入LO2细胞悬液，干预方式同前。干预结束后倒掉培养基，加入含有1%胎牛血清的汉克斯平衡盐溶液(Hanks′)液轻轻地清洗细胞2～3 次。往12 孔板中加入荧光黄溶液(0.5%)1 mL，用手术刀片在培养板中的玻片上划痕，放入细胞培养箱中孵育8 min后将染料吸出，再用含1% FBS的Hanks′液洗涤2～3 次，取出细胞爬片置于载玻片，用明胶封片后在荧光显微镜下观察荧光黄染料的传递情况并拍照。

1.3.6 免疫印迹实验检测Cx26和Cx32蛋白表达

取一块6 孔板，每孔加入LO2细胞悬液，干预方式同前。弃去培养板内的培养基，提取细胞的总蛋白，采用二辛可宁酸法(BCA)测定蛋白浓度后，在蛋白中加入上样缓冲液(蛋白体积∶上样缓冲液=4∶1)，混匀后沸水中煮10 min，使蛋白质变性，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并转膜。采用Cx32，Cx26单克隆抗体和相应二抗分别孵育，以ECL发光法进行显影，β-actin作为参照物。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 药物浓度的选择

2.1.1 LO2细胞脂质损伤模型的建立

以正常培养基和不同浓度的PA分别干预LO2细胞24 h，比较不同浓度的药物对细胞增殖的影响(见图1)，以毒性最小且有造模效应的浓度作为PA造模浓度。与对照组相比，0.1 mmol/L PA组、0.2 mmol/L PA组、0.5 mmol/L PA组、0.8 mmol/L PA组、1 mmol/L PA组、2 mmol/L PA组细胞内活力不断下降，存活细胞不断减少。最终选取0.2 mmol/L PA作为造模浓度。

未加入PA为对照组；**表示与对照组比较P<0.05

2.1.2 不同浓度吴茱萸次碱对LO2细胞活力的影响

采用CCK-8法分别检测不同浓度Rut(0.1 μmol/L，0.3 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L)对LO2细胞增殖的影响，结果显示4个浓度对细胞均没有毒性(见图2)。分别选取0.1 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L三个浓度作为低剂量Rut组、中剂量Rut组和高剂量Rut组完成后续实验。

未加入Put为对照组

2.2 吴茱萸次碱对脂质损伤细胞的活力作用

与对照组相比，给予0.2 mmol/L PA处理后LO2细胞的活力显著降低，不同浓度的吴茱萸次碱(0.1 μmol/L，0.5 μmol/L和1 μmol/L)均能抑制脂质损伤所致的LO2细胞活力的下降(见图3)。

1为对照组，即未加入PA和Rut；2为0.2 mmol/L PA组；3为0.2 mmol/L PA+0.1 μmol/L Rut组；4为0.2 mmol/L PA+0.5 μmol/L Rut组；5为0.2 mmol/LPA+1 μmol/L Rut组；##表示与对照组比较P<0.05，**表示与0.2 mmol/L PA组比较P<0.05

2.3 吴茱萸次碱对脂质损伤细胞内ROS的影响

药物干扰LO2细胞后，采用荧光检测细胞内活性氧的表达情况，如图4显示，与对照组比较，PA刺激细胞后ROS增加，而预先给予吴茱萸次碱(0.1 μmol/L，0.5 μmol/L和1 μmol/L)能够抑制细胞内ROS增加。

a为对照组，即未加入PA和Rut；b为0.2 mmol/L PA组；c为0.2 mmol/L PA+0.1 μmol/L Rut组；d为0.2 mmol/L PA+0.5 μmol/L Rut组；e为0.2 mmol/L PA+1 μmol/L Rut组；绿色荧光代表ROS

2.4 吴茱萸次碱对脂质损伤细胞缝隙连接细胞间通讯功能的影响

划痕负载实验结果显示，与对照组对比，PA可显著抑制荧光黄染料的传递，预先给予Rut(0.1 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L)可显著改善高脂诱导的缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能障碍(见图5)。

a为对照组，即未加入PA和Rut；b为0.2 mmol/L PA组；c为0.2 mmol/L PA+0.1 μmol/L Rut组；d为0.2 mmol/L PA+0.5 μmol/L Rut组；e为0.2 mmol/L PA+1 μmol/L Rut组；绿色荧光代表代表荧光黄探针

2.5 吴茱萸次碱对缝隙连接蛋白Cx26和Cx32表达的影响

免疫印迹实验(Western blotting)结果显示，与对照组比较，PA组Cx32和Cx26的蛋白表达水平显著下降，不同剂量的吴茱萸次碱(0.1 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L)均可恢复Cx32和Cx26蛋白的表达水平(见图6)。

1为对照组，即未加入PA和Rut；2为0.2 mmol/L PA组；3为0.2 mmol/L PA+0.1 μmol/L Rut组；4为0.2 mmol/L PA+0.5 μmol/L Rut组；5为0.2 mmol/L PA+1 μmol/L Rut组

3 讨 论

近几年来，缝隙连接(GJ)在肝脏疾病中的作用日益受到重视。GJ是沟通相邻细胞胞质的细胞间通道，允许相对分子质量小于1.5 kD的离子、代谢物及第二信使(如cAMP，Ca2+，IP3)通过。细胞间普遍存在GJ，相邻细胞通过GJ进行信息和物质能量的交流，在组织生长发育、维持细胞内环境稳定、细胞分裂分化和肿瘤形成发展中发挥重要作用[9]。GJ由相邻细胞膜上的两个连接子互相锚定组成，而连接子则是由六个哑铃型蛋白亚单位-连接蛋白(Cx)组成的六聚体。肝脏结构中存在丰富的GJ，广泛参与肝脏的生理功能，甚至发挥关键作用。目前已有多达5种Cx在肝脏中被检出，其中肝细胞主要表达Cx32和Cx26，而非实质细胞主要表达Cx37，Cx40和Cx43[10]。因此，本研究的目的之一是观察高脂状态的肝细胞中Cx32，Cx26的表达和GJIC功能的变化。

吴茱萸次碱是传统中药吴茱萸的主要有效成分，是一种吲哚喹唑啉类生物碱，具有广泛的药理效应，例如缓解消化性溃疡、抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗炎等，这些作用可能与下调还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶活性，减少ROS产生密切相关[11]。已有研究表明，Rut可减轻高糖诱导的内皮细胞损伤，恢复内皮Cx37表达和GJIC的功能[10]，故而本研究首次在细胞层面上探讨吴茱萸次碱对脂质损伤肝细胞的缝隙连接蛋白和(GJIC)功能的影响。

棕榈酸是饱和游离脂肪酸的一种，已广泛应用于脂毒性诱导细胞损伤模型的建立[12]。本研究利用PA建立人肝细胞的脂质损伤模型，结果显示，PA刺激细胞后导致细胞活性降低、细胞内活性氧增加、GJIC功能障碍以及Cx32和Cx26表达量减少；使用吴茱萸次碱预处理LO2细胞后，可减轻PA诱导的细胞损伤，并且恢复Cx32和Cx26的表达和GJIC的功能[13]。本研究通过探讨肝细胞Cx32和Cx26表达及通讯功能的变化，为治疗非酒精性脂肪肝提供潜在的靶向治疗位点、显著改善NAFLD临床预后以及开发新作用靶点的抗脂肪肝病变药物提供思路。