谭炜富（综述）李薇（审校）

暨南大学附属东莞医院新生儿科，广东 523900

随着我国全面二胎政策稳固推进，我国早产儿发生率及发生数明显升高［1-2］。新生儿高胆红素血症发生率为60%～80%［3］，尤其以早产儿更为多见。作为临床上不可忽视的问题，高水平游离胆红素（unbound bilirubin，UB）对新生儿神经系统具有明显的毒性作用，若不及时诊治将发展为胆红素脑病，可导致一系列神经系统后遗症甚至死亡［4-6］。

1 胆红素生理及神经毒性机制

胆红素是人体血红蛋白代谢后形成的四吡咯微黄色化合物，其中在人体血液中有4种不同的存在方式：未结合胆红素（unconjugated bilirubin，UCB）、UB、结合胆红素（conjugated bilirubin，CB）、delta胆红素（δbilirubin，Bd）。胆红素作为人体正常存在的物质，在一定浓度下，具有很强的抗氧化作用［7］。

然而，UB作为一种脂溶性物质，在其高水平时可穿透血脑屏障并沉积在中枢神经系统特定区域，导致该区域神经元坏死及黄染［8-9］。迄今为止，胆红素神经毒性机制尚不清楚，尚有多项研究认为与多种细胞及分子通路参与有关，以上机制破坏细胞膜完整性及其功能、诱导神经元内质网应激、诱发线粒体及DNA损伤、影响神经突触兴奋性，最终导致神经元细胞凋亡、坏死［6，10-14］。

2 早产儿胆红素脑损伤的表现

反复的氧饱和度降低以及呼吸暂停可能是急性胆红素脑病（acute bilirubin encephalopathy，ABE）的唯一表现［6］，而早产儿具诊断意义的呼吸暂停有时可表现为皮肤黏膜“发绀”，无序的呼吸控制则是ABE患儿一个显著特征。核黄疸时，胆红素的神经毒性作用而可致早产儿罹患永久性的神经后遗症，除了经典的核黄疸，即包括肌张力障碍及手足徐动型脑瘫、听力损害、眼球上转运动障碍和牙釉质发育不良以外，还可因蜗后听觉系统损害而表现为听觉型核黄疸［15-16］。当胆红素神经毒性表现为相对轻微的神经发育障碍，则多无典型核黄疸的表现，可有轻至中度的运动异常、肌张力障碍、感觉运动整合不协调等，称为胆红素诱导的神经功能障碍（bilirubin-induced neurological dysfunction，BIND）［17-18］。

除以上所述各类胆红素脑损伤外，尚有一临床棘手且不可预料的类型，即是较低胆红素水平所致的核黄疸。此类患儿的血清胆红素水平低于产生神经毒性所需的胆红素水平，虽罕见但不容忽视［19］。

3 血清UB检测方法

3.1 酶法 酶法检测UB的研究众多，其基本原理是胆红素过氧化酶可催化胆红素氧化以对其定量检测。钒酸盐氧化酶法通过钒酸将胆红素氧化为胆绿素，对比传统重氮法检测胆红素更简单快速，且可用于含有干扰物质的样品检测［20］。而Andreu等［21］设计了一种使用胆红素氧化酶/荧光素结合物的新技术同时对血清中的UB、白蛋白结合胆红素和CB 3种类型胆红素进行检测分析。此种方法的酶经过修饰可在波长为487 nm和520 nm处有激发和发射荧光。然而，这种新方法的准确性及敏感性不足以用于临床样本的UB检测。

Ahlfors等［22］运用区域流体系统通过过氧化物酶法测量血液中游离UCB，该方法通过使用小口径管道构建一种由计算机控制的区域流体系统，实现了胆红素检测的自动化，避免了商业上获得的过氧化物酶法的诸多限制。该方法精确度高，但受到酶稳定性的制约。

3.2 色谱法 精确检测胆红素量的色谱法众多，而高效液相色谱法（HPLC）是目前可分离并直接测定4种不同胆红素成分的最精确方法之一。Zelenka等［23］开发了基于高灵敏度HPLC的方法测定胆红素，该方法仅通过简单快速的样品制备步骤即可检测组织和体液中的胆红素。新近的Martelanc研究团队创新性地将高效液相色谱仪与热透镜光谱检测（TLS）联合对人类血清UB进行精确检测，实验证明HPLC-TLS检测法拥有超高的灵敏度，检测精度达到了pM水平，进行血清样本检测时无需进行处理即可加样检测［24-25］。然而，以上研究仅针对成人血清样本进行探索，并没有针对非成人样本的研究数据。李建瑜与李薇［26］则在改进HPLC法的同时，开创性地测定了13例高胆红素血症新生儿，并测得此组患儿血清UB水平为（548.20±107.19）nmol/L，填补了此类研究在新生儿方面的数据空白。

3.3 电化学法 电化学法按有无酶促过程可分为两类不同的检测UB的方式，其一是非酶促方法，其二是运用胆红素氧化酶（bilirubin oxidase，Box）的酶促生物传感方法。

Box作为生物信号分子广泛用于胆红素的电化学测定中，其可催化胆红素产生氧化还原指示剂过氧化氢，或可通过辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）间接反应而产生电位信号。有报道将Box与HRP同时固定在石墨-环氧基质上形成一种双酶传感器，可提供测定胆红素的低电势，运用该方法其胆红素的检测极限为4µM，线性范围可达到10 mM［27］。有研究还通过运用电子传递介体（electron transfer mediators，ETM）以增强检测的灵敏度［28］。Chauhan等［29］通过将Box共价固定于有氧化锆涂层的二氧化硅纳米粒子上，组成一种复合电极，通过这种电极可得到胆红素检测的极限值是0.1 nM。另外还有报道显示，抗坏血酸氧化酶可代替Box作为生物信号分子用于电化学法测定胆红素［30］。

关于非酶电化学方法测定胆红素的报道很多。Yang等［31］运用分子印迹和表面溶胶-凝胶技术开发了新型高灵敏度石英晶体微天平传感器，该传感器对胆红素具高度选择性，其线性范围为0.1～50.0µM，检测限为0.05µM。

3.4 电泳法 毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）是一种高效的分离技术，仅需少量血清样品即可进行快速检测，可用于测定新生儿血清胆红素［32-33］。有研究报道将CE与前沿分析（frontal analysis，FA）结合以确定混合溶液中UB及其与白蛋白结合的能力［34］。该研究还发现向胆红素-白蛋白混合物添加阿司匹林可将胆红素分离。此项成果可用于评价高胆红素血症患儿的残余白蛋白结合能力，为新生儿胆红素神经毒性风险管理提供新的思路。Nie与Fung［33］运用上述CE结合FA，开发了通过聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）多通道微流控芯片测定胆红素及其白蛋白结合能力的床旁检测仪器。这种仪器可在发生黄疸之前检测UB的早期升高水平，而且成本低、检测快速，可作于新生儿胆红素床旁监测。

3.5 荧光法 荧光测定法在其发展阶段，曾使用荧光标记的脂肪酸结合蛋白突变体作为探针，对UB具有高度的特异性和敏感性。Huber等［35］使用一种被标记了荧光分子丙烯酰胺的突变脂肪酸结合蛋白（BL22P1B11）并使其与胆红素结合，而后其荧光被淬灭，可通过BL22P1B11-Rh装置探测荧光的改变而做出响应。通过手持式游离胆红素仪或实验室荧光计，BL22P1B11-Rh探头可进行1 min/次的测量，并提供精确的血清UB浓度值。Santhosh等［36］使用金纳米簇作为荧光探针以检测血清中UB。金纳米簇对人血清白蛋白稳定，由于胆红素与血清白蛋白的相互作用，将导致金纳米簇的荧光猝灭。此项技术可用于无干扰胆红素检测，检测限为（248±12）nM。该技术亦可用于比色检测，加入过氧化氢后金纳米簇将具过氧化物酶活性，可催化检测样品中UB成无色物质，可实现样品的UB比色。

3.6 分光光度法 胆红素可通过各种分光光度法进行测量。直接分光光度法是新生儿最常用的血清胆红素的检测方法，该方法在波长为454 nm和528 nm处进行测量［37］。因胆红素在波长454 nm处被吸收，而血红蛋白在454 nm及528 nm处均等吸收，故波长528 nm处的吸光度与454 nm处的吸光度的差值即是胆红素的吸光度。然而，因其检测的不精确性，限制了该方法在出生3周以内新生儿的运用。有课题组针对自动进样进行了新的探索。Vichapong研究团队开发了同时进样有效混合流系统（simultaneous injection effective mixing flow analysis，SIEMA）用以测定尿液中的尿胆素原和胆红素，此系统由进样泵、连接器、固定线圈、混合线圈和光谱仪组成，通过此系统的4个通道可分别检测胆红素及尿胆素原（尿胆素原和胆红素的检测限分别为1.0 mg/L和0.003 mg/L）［38］。

3.7 压电技术 石英晶体微量天平（quartz crystal microbalance，QCM）作为压电原理的应用之一，可用于检测物质细微的质量变化。因其具有高灵敏度、灵活便携、价格实惠的优点，也可用于进行UB的检测。联合运用分子印迹技术与QCM技术可以开发具有高度选择性和更为灵敏的胆红素检测系统［39］。Yang等［31］基于分子印迹和表面溶胶-凝胶技术，通过压电方法对将胆红素印迹的二氧化钛膜修饰到石英晶体上，开发出了用于测定胆红素的新型QCM传感器。此种方法具有高选择性、高灵敏度、高可重复性，其响应时间仅30 min，检测胆红素线性范围在0.1～50.0µM，检测限为0.05µM。有研究则通过分子印迹技术，在QCM芯片表面上合成胆红素印迹聚合物纳米膜，所制得的QCM传感器可用于检测人血浆胆红素时，其检测限和定量限分别为0.45µg/ml和0.9µg/ml［40］。

4 结 语

高水平的UB对新生儿尤其是早产儿具有显著的神经毒性，可造成严重神经系统损伤，导致残疾甚至死亡。血清UB因可通过血脑屏障并诱导神经元凋亡、坏死，故及时检测新生儿血清UB至关重要。目前针对新生儿血清UB的检测方法众多，可分为酶法、色谱法、电泳法、荧光法、分光光度法和压电技术等，每种方法都有其特点及适用条件。临床儿科医生或检验人员在进行对新生儿血清UB进行检测时，应根据具体实际对检测方法进行选择，以期获得更好的检测结果，优化新生儿高胆红素血症及早产儿胆红素脑损伤的防治方案。