于进洋，韩旭，谭红略

1.河南中医药大学，河南郑州450046；2.湖南中医药大学，湖南长沙410208；3.河南省正骨研究院，河南洛阳471002

葡萄球菌属革兰氏阳性菌属，其中大多数无致病性，但金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）及表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis，SE）作为葡萄球菌的主要菌种，具有较强的致病性［1］。研究显示，葡萄球菌尤其是耐药葡萄球菌所致的临床难治性感染超过80%的病例与细菌生物膜的形成相关［1-2］。细菌生物膜是指细菌在极其严苛的生长条件下，为了保护自己不受周围环境的影响，附着在生物或者非生物体的表面，包裹在其分泌的胞外聚合物基质中，形成可以适应周围多样性环境的细菌群体，是细菌生存的一种特殊形式［3-4］。细菌生物膜的形成可以分为3个阶段，即初始附着阶段、聚集成熟阶段和最后的脱落播散阶段，其形成受群体感应系统（quorum sensing，QS）和相关的细胞因子调控，是一个精密而复杂的过程［5］。细菌生物膜的形成增强了细菌的耐药性，生物膜屏障下的细菌对抗生素的抗性是浮游细菌的1000倍，高耐药性使得葡萄球菌所致的感染往往迁延难愈［6］。寻求抑制葡萄球菌生物膜形成的方法成为治疗难治性感染的关键所在。

近年来，随着对中医药资源的不断发掘，中药在治疗葡萄球菌生物膜导致的难治性感染方面显示出较为明显的优势，且由于中药方便获取、不良反应小、价格较抗生素便宜、不易导致细菌的耐药等优点，已成为继抗生素之后抗感染的重要途径和研究方向之一［7-8］。本文就中医药抑制葡萄球菌生物膜形成的效用及机制的研究进展综述如下。

1 中医药对于葡萄球菌生物膜形成的抑制作用

1.1 单味中药提取物目前，随着药物研究水平的不断提高，发现许多单味中药的提取物具有明显的抗感染作用，对葡萄球菌生物膜的形成有不同程度的抑制效用。何谷良等［9］研究黄芩提取物黄芩苷对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA）的影响，结果表明，黄芩苷对MRSA的最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）、最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）及最小生物膜清除浓度（minimum biofilm eradication concentration，MBEC）分别为1 g·L-1、0.5 g·L-1和0.5 g·L-1，说明黄芩苷不仅可以抑制MRSA，还对其生物膜有清除作用。李玲等［10］研究小檗碱（黄连素）对MRSA的抑制作用，发现小檗碱对MRSA的MBC、MIC及MBEC分别为0.4 g·L-1、0.2 g·L-1和0.2 g·L-1，说明小檗碱不仅对MRSA的增殖具有抑制作用，而且对其生物膜的形成也有着一定的抑制作用。汪伦记等［11］研究了在不同添加时间和不同质量浓度下冬凌草提取物对SA生物膜形成的抑制作用，结果表明，冬凌草提取物对SA生物膜抑制作用的强弱与添加时间成反比，而与质量浓度成正比，即在SA生物膜形成初始阶段添加高浓度（＞1MIC）冬凌草提取物对生物膜的清除效果最佳。冯韬等［12］通过观察6种中药提取物对SA生物膜形成的影响发现，在液体浓度为1MIC时，蒲公英、板蓝根和白头翁3种中药的醇提液对生物膜的抑制率都高于80%，但在1/16 MIC或1/32MIC的低浓度下，大青叶和白头翁的水提液以及大青叶和柴胡的醇提液却有利于生物膜的形成。崔新洁等［13］研究24味中药的水提液对SA的抑菌作用发现，连翘、蒲公英、淫羊藿、蜂房、毛冬青、高良姜、牡丹皮、苦参、吴茱萸、姜黄、附子、菟丝子、肉豆蔻、金银花、肉桂、冰片、当归、杜仲、鱼腥草、天冬20种中药的水提液对SA的MIC均≥200 g·L-1，对SA生物膜的抑制作用差；五倍子、苏木、黄芩及丹参的水提液对SA的MIC分别为0.39 g·L-1、12.5 g·L-1、50 g·L-1及100 g·L-1，对生物膜的抑制作用较好；五倍子和黄芩的水提液在1/2MIC和1/4MIC的浓度时就能很好地起到抑制生物膜的效果，同时可以较好地起到清除生物膜的作用。霍佳楠等［14］通过研究蒲公英水提液对SA生物膜形成的影响发现，蒲公英水提液在1/2MIC、1MIC、2MIC的浓度下对SA生物膜有清除作用，且浓度越高，清除作用越大。喻华英等［15］探讨甘草提取物对SA生物膜的影响，结果表明，低浓度条件下的甘草提取物有利于生物膜的生长，高浓度条件可抑制生物膜的形成和生长。朱明等［16］研究了新疆黑蜂胶提取物对SA生物膜的影响，结果显示当MIC为6.25 g·L-1时，黑蜂胶提取物可抑制SA生物膜的形成，且高浓度的黑蜂胶提取物可破坏成熟的SA生物膜，其抗菌活性甚至可等效于青霉素。

对单味中药的水煎液也有相应的研究。李延荣等［17］探讨了新疆的盐穗木、苦豆子、甘草、醉马草4种特色植物的水煎液对SA生物膜的影响，研究表明，甘草、盐穗木水煎液在低浓度时对SA的生长没有影响，但可抑制其生物膜的形成；高浓度时，不仅可以影响SA的生长，还可以抑制其生物膜的形成，甚至对生物膜具有清除能力；醉马草和苦豆子水煎液可以抑制SA生物膜的形成但不能抑制细菌的生长。裴金乐［18］研究金银花水煎液对SE的抑制作用发现，当MIC为125 g·L-1时，金银花水煎液对SE的抑制作用开始显现，但当MIC为250 g·L-1时，金银花对SE的抑制作用达到顶峰，不再增加。上述研究可以发现，单位中药的提取物及水煎液对葡萄球菌生物膜有较好的抑制作用，且因其实验操作简单、成分单一，更有利于中药活性成分的发掘，是当前中药抑制生物膜的研究热点。

1.2 中药复方当前，中医药对临床感染性疾病研究所运用的中药复方多是对经典经方的继承或当代名老中医的经验方，只要临床辨证准确，疗效是确切的。许多方药对于体外抑制葡萄球菌生物膜的形成有效。新加达原散（清透方）由温病大家吴又可、杨栗山的名方达原饮、升降散及经方小柴胡汤方加减而成，有凉血解毒、开达膜原之功效。左雪［19］通过初步探索新加达原散对SA的抵抗作用发现，新加达原散不仅在SA生物膜形成的初期抑制其形成，在生物膜成熟后还可进入其内部对膜内细菌进行杀灭。复方白玉散为名老中医刘再朋的经验方，针对难愈性创面具有解毒敛疮之功效。姚孝明等［20］研究复方白玉散浓缩溶液对SA的体外抑菌作用发现，该方对SA生物膜的形成有抑制作用，且对SA有抑制和杀灭作用。

除了对复方汤剂研究外，文献对复方注射剂、散剂及水提液对葡萄球菌生物膜的影响也有深入的研究。痰热清注射液由5种中药组合而成，可用于治疗风温肺热之痰热阻肺证。刘钰玲［21］研究痰热清对MRSA的作用发现，痰热清对MRSA生物膜的生长及成熟阶段均有抑制作用，且可以穿透生物膜，通过杀菌效用减少膜内的活菌数量。Wang等［22］也对痰热清对于SA生物膜的作用进行了研究，发现痰热清可抑制SA生物膜的生长，并可进入膜中杀死活的细菌。脱管散是甘肃中医学院附属医院的院内制剂，由宫粉、冰片、枯矾、轻粉和麝香5味中药组成，外用治疗疮疡溃烂等疾病疗效明显，有去腐生肌的功效。张秀［23］研究发现脱管散对SA生物膜的形成有抑制作用，在其成熟期还具有破坏作用。清开灵颗粒有清热解毒的功效，对于急性炎症有良好的疗效。李将等［24］研究结果表明，当清开灵药液浓度在3.9～62.4 g·L-1浓度区间时，浓度越高，对SA生物膜的破坏作用越强。韩雪等［25］也对清开灵注射液抑制SA生物膜的作用进行了研究，发现清开灵可以破坏SA生物膜结构，使其生物膜变得疏松，与青霉素相比，其对成熟期的生物膜有更强的破坏力。连花清瘟胶囊作为中成药，有良好的抗病毒作用，治疗流感及呼吸道感染有较好的疗效。王艺竹等［26］探讨了连花清瘟胶囊水提物对MRSA细菌生物膜的影响，研究表明，在浓度为173～10.81 g·L-1时，连花清瘟水提物对MRSA的生物膜形成有抑制作用，而浓度为173 g·L-1时，可使MRSA生物膜变薄，并且显著杀灭膜内细菌。雷洪涛等［27］对于连花清瘟胶囊抑制MRSA生物膜的作用做了研究，发现连花清瘟胶囊一方面可以对生物膜基质进行分解，破坏MRSA的细菌生物膜屏障，另一方面可以穿过生物膜对膜内细菌进行杀灭。上述研究可以发现，中药复方作为临床最主要的中药治疗手段，其药物组成复杂，不仅对生物膜的形成有抑制作用，而且大部分复方还对生物膜有清除作用。因此中药复方在治疗生物膜相关感染性疾病中应用前景广泛。

2 中医药抑制葡萄球菌生物膜形成的机制

SE和SA形成生物膜的能力是当前内置物感染难以治疗的重要因素。随着对细菌生物膜机制的深入研究，发现葡萄球菌生物膜形成的分子基础及调控因子主要是多糖胞间黏附素（polysaccharide intercellular adhesin，PIA）、胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）、细胞壁锚定蛋白（cell wall-anchored proteins，CWA）、QS、酚溶性调控蛋白（phenol-soluble modulins，PSMs）和全局性调控因子（carbon storage regulator，CsrA）等［28］。由此可见，细菌生物膜的形成机制极其复杂。目前，中药单体及其复方对于葡萄球菌生物膜作用的研究大都停留在表象，只有少部分研究与葡萄球菌生物膜形成的机制相关。

2.1 中药单体苦参总碱是从苦参中提取的活性成分，有抗炎、抗病毒的功效，可用于感染疾病的治疗。王李俊等［29］体外培养SE细菌生物膜，观察苦参总碱对生物膜的抑制作用，并探索其作用机制，结果表明苦参总碱对SE生物膜的形成有明显抑制作用，其作用机制是对SE氧化应激响应基因gpsA-2和serp2195（分别编码二氢硫辛酰胺脱氢酶和编码谷胱甘肽过氧化物酶，是具有消除氧化压力作用和还原过氧化物的2种蛋白酶）表达具有下调作用。丹参酮类化合物是丹参的主要有效成分，而丹参酮类化合物中的有效单体成分隐丹参酮对浮游的SE有清除作用。易辉等［30］以万古霉素为对照探讨了亚抑菌浓度下隐丹参酮对SE生物膜形成的作用，结果表明，万古霉素和隐丹参酮对SE的MIC分别为4 mg·L-1和2 mg·L-1。MIC下的万古霉素和隐丹参酮均能抑制SE生物膜的基质量、自溶素基因表达和膜内菌代谢活性，而且同在亚抑菌浓度下，隐丹参酮的抑制作用明显强于万古霉素。熊果酸又名乌苏酸，是一种天然萜类化合物，广泛存在于具有抗炎作用的天然植物中，如野木瓜、熊果及夏枯草等，有一定的抗菌、抗炎和抗病毒作用［31］。李洋等［32］研究结果发现，当MIC为0.27 mmol·L-1时，熊果酸可对SA生物膜早期的形成有抑制作用，其机制可能为抑制胞外多糖的合成，而且熊果酸与左氧氟沙星联合用药可增强对SA生物膜的抑制作用，破坏其完整性。和厚朴酚是从中药厚朴中提取的主要活性成分，有抗菌和抗炎作用。乔瑞红等［33］研究了和厚朴酚抑制MRSA生物膜生长及成熟时期的作用机制，结果表明，不论生物膜处于生长阶段还是成熟阶段，和厚朴酚都有较好的抑制效果，其机制是通过抑制eDNA和PIA的合成产生影响，达到抑制生物膜形成的目的。此外，和厚朴酚还可通过调控细菌QS系统的附属基因调节子（accessory gene regulator A，agrA）的表达量影响生物膜的形成。盐肤木，又称五倍子树，其树叶的乙醇提取物有一定的抗炎、抗菌作用。You等［34］研究了盐肤木乙醇提取物对MRSA生物膜的影响，结果表明，当其提取物MIC高于0.05 g·L-1时，对MRSA生物膜有显著的清除作用，而且还可通过影响agrA和辅助调节子（staphylococcal accessory regulator A，sarA）等生物膜相关基因表达对生物膜产生抑制作用。上述研究可以发现，中药单体对于抑制生物膜机制探究有一定的成果，但是探讨相对模糊，需要更深层次的挖掘。

2.2 中药复方鼻渊舒口服液由清胆泻热的代表方吉雷开窍汤加减而成，药物以清热药黄芩、栀子为主，有清除胆腑郁热的功效。曹刘［35］在对鼻窦炎的治疗中研究了鼻渊舒口服液对于SE生物膜相关agrA和luxS基因的调控，结果表明，鼻渊舒口服液对SE生物膜有明显的抑制作用，其作用机制主要是通过上调luxS基因降低自身诱导信号分子-2（autoinducer-2，AI-2）的信号，负调控达到成膜抑制效果；下调agrA基因，正调控达到抑膜效果；对altE基因的调节既有上调也有下调，表明鼻渊舒口服液并非通过agr-altE通路的单一线性调节影响SE生物膜的形成。复方四黄外洗液由《肘后备急方》中的黄连解毒汤加减而成，有清热解毒、去腐生肌的功效，可治疗以火毒、热毒为证候的疮疡病。陈晓坚［36］研究了复方四黄外洗液对MRSA生物膜形成的抑制作用，结果表明，复方四黄外洗液可显著抑制MRSA生物膜的形成，其作用机制可能为通过阻碍细菌的黏附、生长以及胞外多糖的分泌，从而抑制或推迟生物膜的形成。综上可以发现，中药复方对于生物膜作用突出，但其成分复杂，对机制探讨的基础研究相对较少，需进一步加强。

3 结语

近年来，随着临床上抗生素的大幅使用甚至滥用，细菌耐药问题越发严重，多重耐药菌株的出现更加提醒人们要引起重视［37］。细菌耐药究其原因主要是生物膜的形成，生物膜保护膜内的细菌，使其免于宿主及抗生素的攻击，使感染性疾病迁延难愈。当前有关中医药抑制葡萄球菌生物膜形成的基础研究相对较少，与骨科内植物细菌生物膜形成相关的基础研究更少；同时，对其复杂作用机制的研究也相对较为薄弱，且文献多是探讨单纯中药单体或复方的报道。而临床实际治疗感染是抗生素与中医药的辨证结合。针对骨科临床，往往也是全身或局部抗生素与中药方的全身或局部的组合应用。因此，针对骨科临床常见的局部骨关节感染，除了加强对单纯的中药复方或单体抑制葡萄球菌生物膜形成的基础研究外，更应该关注组合抗生素情况下对生物膜形成的影响；同时，深入探讨中医药单用及组合抗生素应用抑制葡萄球菌生物膜形成的机制，为与骨科内植物细菌生物膜形成的相关感染性疾病的治疗提供思路。