褚小磊,柴继侠,郭 帅,王元元,陈传好*

(1蚌埠医学院人体解剖学教研室，蚌埠 233030；2组织移植安徽省重点实验室；3蚌埠医学院组织学与胚胎学教研室；4感染与免疫安徽省重点实验室；*通讯作者,E-mail:cch711124@sina.com；#共同通讯作者，E-mail:wanyuanyuantcm@126.com)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是常见的自身免疫性炎症性关节病[1]。目前认为主要的病因包括遗传学、表观遗传学、环境、生活方式的改变，这些因素共同导致慢性炎症、血管新生、关节破坏，甚至引起进展性残疾、全身并发症、早期死亡[2]。血管新生(angiogenesis)是从现有血管重生新血管，是新组织发育、生长和组织修复的重要方面，在RA早期阶段起着关键作用[3]。近年来，许多研究证明血管新生在炎症和免疫应答持续存在的过程中发挥着重要作用，并支持RA血管翳生长和发展[4]。同时，已有研究表明在RA中阻断血管新生可以抑制滑膜炎症以及血管翳形成[5-7]。有针对性的免疫治疗和积极的治疗策略大大改善了病情的进展，但目前还没有治愈的方法，同时，服用这类药物通常会发生各种不同的副作用，且费用高，这使得临床应用受到限制[8]。亟待寻找新型潜在的药物。槲皮素(quercetin，QUE)是众多天然类黄酮化合物中的一种，存在于多种水果和蔬菜中，具有独特的生物学特性，包括抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒、免疫调节[9,10]，以及抑制毛细血管通透性和预防骨质疏松症[11]，同时毒副作用小，可以作为一种有前景的安全治疗策略[12]。在RA中进行的一系列体内外研究表明，槲皮素通过多种途径影响RA疾病的进展。因此，本文研究槲皮素在RA中是否具有抗血管新生作用，以及潜在的机制。

1 材料和方法

1.1 试剂

槲皮素(纯度98%)和DMSO(纯度99%)分别购自美国MedChemExpress公司和德国Biofroxx公司。不完全弗氏佐剂(IFA)和牛Ⅱ型胶原(C Ⅱ)获自美国Chondrex公司。兔抗大鼠HIF-1α、兔抗大鼠CD34、小鼠抗大鼠VEGFA和二抗(山羊抗兔免疫球蛋白G辣根过氧化物酶)、ELISA试剂盒均购买自武汉Abclonal公司。一抗β-actin、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PMSF、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、PVDF膜、ECL化学发光底物试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、RIPA裂解缓冲液均产于上海Beyotime公司。山羊血清购买于武汉Elabscience Biotechnology公司。柠檬酸钠抗原修复液、苏木精、伊红染料购自北京Solarbio公司。

1.2 动物

从济南朋悦实验动物繁育有限公司获得24只SPF级雄性SD大鼠(体质量180-220 g)，合格证号：SCXK(鲁)20190003。饲养温度26-28 ℃，光照12 h，均自由进食和饮水，适应性喂养1周后在无菌环境中进行整个实验。该研究所有协议均由蚌埠医学院动物实验伦理委员会审查和批准(审查编号2020-084)。

1.3 方法

1.3.1 胶原诱导大鼠关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型的建立和槲皮素治疗 为明确槲皮素对关节炎的影响，采用SD大鼠通过以下步骤[13]建立CIA模型：C Ⅱ溶解于0.01 mol/L醋酸中配制成2 mg/ml浓度，在4 ℃下过夜，然后与等体积的2 mg/ml IFA充分乳化后于第0天在大鼠尾根部皮内注射(0.2 ml)诱导炎症(初次免疫)。初次免疫后第7天，在大鼠右后肢皮内注射相同体积的该乳剂，以增强初次免疫(第2次免疫)。将无关节肿胀体征的动物移除。CIA大鼠随机分为：CIA组(n=6)和QUE组(n=6)，并选择6只正常大鼠作为正常对照组(control)。以往研究表明，在CIA大鼠模型中，给予QUE(150 mg/kg)可显著改善大鼠关节炎症[14]，所以本实验采用该剂量灌胃。在初次免疫后第14天，每天1次，直至实验结束(初次免疫后35 d)，QUE粉末溶解于0.05% DMSO溶液中，QUE组按150 mg/kg体质量(下同)经口灌胃给药；control组和CIA组仅给予等体积0.05% DMSO溶液。

1.3.2 关节炎评价 关节炎病变程度参考文献评分标准进行评估[15]。在初次诱导后的第14天开始，每3 d由两个独立的观察者进行关节炎评分的评估：0分，没有红肿；1分，脚趾和脚踝轻度肿胀；2分，脚趾和脚踝中度肿胀；3分，脚趾和脚踝严重肿胀；4分，整个脚掌肿胀，有强直。四只足爪的得分相加，最大得分为16分，表示最严重的程度，同时测量每只大鼠左后肢足爪体积以及大鼠体质量，直至实验结束。

1.3.3 组织病理学评估 初次免疫后第35天，在10%水合氯醛麻醉后，通过颈椎脱臼法处死大鼠。解剖双后肢踝关节，立即在4%多聚甲醛中固定24 h。在4 ℃下，10% EDTA中脱钙处理1个月，每隔1 d更换脱钙液。包埋在石蜡中，组织切片(4 μm)固定在普通玻片上，苏木精伊红(HE)染色。由两名专业的病理学观察者对所有切片进行随机分组和评价，观察者对给药组和每只大鼠的关节炎严重程度设盲。数据表示为平均滑膜炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成、软骨侵蚀评分。使用5个高倍放大视野(HPFs)平均值评分进行分析，关节组织病理学评分见表1[16]。

表1 关节组织病理学评分

1.3.4 免疫组织化学(IHC)检测CD34、VEGFA、HIF-1α蛋白表达 采用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-biotin-peroxidase，SP)法进行操作。将组织石蜡切片在68 ℃下烘烤20 min。用二甲苯对组织进行脱蜡，梯度乙醇(由高到低)水化，将切片浸泡在柠檬酸钠抗原修复液中，95 ℃加热约15 min，随后用0.3%过氧化氢处理以阻断内源性过氧化氢酶活性，然后用PBS溶液洗涤3次×5 min，添加山羊血清封闭液后在室温下放置20 min，用PBS溶液浸洗3次×3 min后分别将切片与CD34(1 ∶100)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)(1 ∶150)、HIF-1α(1 ∶200)的一抗孵育在4 ℃下过夜，再次用PBS溶液浸洗5次×5 min，然后用相应的二抗在37 ℃孵育1 h，接着用PBS洗涤。使用二氨基联苯胺(DAB)进行着色，苏木精复染2 min，常规脱水，透明和固定后中性树胶封片，最后进行显微镜观测。使用血管内皮细胞特异性抗原CD34作为检测指标，对踝关节4 μm厚石蜡包埋切片进行微血管和单内皮细胞染色。基于0-3等级评分(见表1)，观察滑膜微血管密度，并评估滑膜组织CD34、VEGFA、HIF-1α蛋白表达情况，在200倍光学视野下选择最丰富的血管区域，然后在400倍光学视野下计数5个高微血管密度区域的并取平均值。用Image Pro Plus 6.0软件进行累积光密度(IOD)评估，结果表示为平均感兴趣区域，表示在放大倍数为400倍时每张图像被阳性染色细胞覆盖的面积百分比[17]。

1.3.5 免疫印迹(Western blotting)检测VEGFA和CD34蛋白表达 在初次免疫后第35天，无菌环境下分离大鼠膝关节滑膜，简言之，大鼠在10%水合氯醛麻醉后，固定下肢、消毒、铺巾，沿髌骨前方纵行切开皮肤及皮下组织，暴露髌韧带，沿髌骨下缘横断髌韧带，暴露并分离滑膜，淡黄色的软组织即为滑膜(见图1)。在RIPA裂解缓冲液中使用组织研磨机裂解关节滑膜组织，并在12 000g下离心10 min，得到蛋白提取物，使用BCA法测定蛋白浓度。通过6%和12% SDS-PAGE电泳分离关节滑膜组织蛋白，并转移至0.45 μm PVDF膜上，用3%脱脂牛奶室温封闭2 h后，一抗(VEGFA、CD34、β-actin)分别按1 ∶500、1 ∶500、1 ∶1 000稀释，4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗3次，每次10 min，二抗按1 ∶8 000稀释，室温下孵育2 h，TBST溶液洗3次。使用ECL化学发光底物试剂盒显影，Bio-Rad凝胶成像系统对膜进行曝光并获取图像。

A.固定、消毒、铺巾 B.切开皮肤及皮下组织 C.切开髌韧带、分离暴露滑膜 D.获取滑膜图1 大鼠关节滑膜组织的分离和提取Figure 1 Isolation and extraction of rat synovial tissue

1.3.6 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-17表达水平 在初次免疫后第35天采集大鼠血清，3 000 r/min离心15 min后，使用ELISA试剂盒(武汉Abclonal公司)，在450 nm和570 nm处测定吸光度，检测血清TNF-α、IL-1β、IL-17表达水平。每个指标进行3次重复实验。

2 结果

2.1 槲皮素可延缓CIA大鼠关节炎进展并降低关节炎严重程度

从初次免疫后第14天开始，观察到CIA组大鼠关节明显肿胀，槲皮素治疗后关节肿胀明显减轻(见图2)。CIA组大鼠关节炎评分逐渐升高，在第30天左右达到高峰与control组比较，差异有统计学意义(P<0.001)；QUE组大鼠关节炎评分在初次免疫后第26天开始，评分逐渐下降,与CIA组比较，差异有统计学意义(P<0.05，见图2)。从第14天开始，CIA组大鼠体质量逐渐下降，在第23天左右达到最低，之后升高并维持相对较低的水平，与control组比较，差异有统计学意义(P<0.05，见图2)；QUE组大鼠体质量从初次免疫后第26天开始逐渐上升，但是与CIA组相比无明显差异。CIA大鼠左后足体积从第14天开始升高，与control组比较，差异有统计学意义(P<0.01，见图2)；与CIA模型组相比较，从初次免疫后第20天开始，槲皮素能显著降低关节炎大鼠足爪体积(P<0.05，见图2)。

2.2 槲皮素减轻CIA大鼠关节组织病理学改变

HE染色结果显示，正常对照大鼠踝关节结构正常，滑膜无增生、水肿，关节软骨表面光滑，未见血管翳，软骨基质和软骨细胞无损坏；CIA大鼠具有显著的关节炎组织病理学变化，包括炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳以及骨、软骨破坏；然而，槲皮素治疗明显减轻CIA大鼠的关节炎组织病理学变化(见图3)。

与control比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；与CIA组比较，#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001图2 槲皮素对CIA大鼠关节炎评分、体质量、足爪体积影响Figure 2 Effect of quercetin on arthritis score, body weight and foot and paw volume in CIA rats

与CIA组比较，#P<0.05，##P<0.01图3 槲皮素对CIA大鼠关节炎发病过程及组织病理学变化的影响Figure 3 Effect of quercetin on the pathogenesis and histopathological changes of arthritis in CIA rats

与CIA组比较，QUE组CIA大鼠踝关节组织病理学严重程度评分、滑膜炎性评分、滑膜增生评分、血管翳评分、软骨侵蚀评分均明显降低(P<0.05，见图3)。

2.3 槲皮素抑制CIA大鼠关节滑膜组织血管新生

CIA组大鼠炎症关节滑膜组织中存在大量CD34、VEGFA、HIF-1α阳性染色，而QUE组大鼠炎症关节滑膜组织中的CD34、VEGFA、HIF-1α染色明显减弱(见图4)。统计结果表明，与control组比较，CIA大鼠关节滑膜组织中的微血管密度以及CD34、VEGFA、HIF-1α的表达均升高(均P<0.01，见图4)；与仅接受0.05% DMSO溶液给药的CIA大鼠相比，150 mg/kg槲皮素可显著降低CIA大鼠炎症关节滑膜组织中的微血管密度以及滑膜组织中CD34、VEGFA、HIF-1α的表达(均P<0.01，见图4)。

2.4 槲皮素对CIA大鼠关节滑膜中VEGFA、CD34的影响

采用Western blotting分析检测滑膜组织中VEGFA和CD34蛋白表达水平。结果表明，与control组相比，CIA组大鼠关节滑膜中VEGFA和CD34的表达升高(P<0.01，见图5)。相比于CIA组，QUE组CD34表达无明显变化，VEGFA表达明显降低(P<0.01，见图5)。

与control组比较，**P<0.01；与CIA组比较，##P<0.01图4 槲皮素对CIA大鼠关节滑膜中微血管密度以及CD34,VEGFA,HIF-1α的影响Figure 4 Effect of quercetin on density of synovial blood vessels in collagen-induced arthritis rats and expression of CD34, VEGFA, HIF-1α in joint synovium

与control组比较，**P<0.01；与CIA组比较，##P<0.01图5 Western blotting检测槲皮素对CIA大鼠关节滑膜中VEGFA、CD34的影响Figure 5 Effect of quercetin on VEGFA and CD34 in the synovium of CIA rats by Western blotting

2.5 槲皮素对CIA大鼠血清TNF-α和IL-1β、IL-17水平的影响

采用ELISA检测初次免疫后第35天大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-17的表达水平。结果表明，与control组相比，CIA组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-17水平升高(P<0.01，见图6)。与CIA组比较，槲皮素组CIA大鼠血清中的TNF-α、IL-1β和IL-17明显抑制(P<0.05-0.01，见图6)。

与control组比较，**P<0.01；与CIA组比较，#P<0.05，##P<0.01图6 槲皮素对血清TNF-α、IL-17、IL-1β水平的影响Figure 6 Effect of quercetin on plasma levels of TNF-α, IL-17 and IL-1β

3 讨论

RA是一种复杂的免疫介导疾病，临床表现主要涉及滑膜炎症和关节损伤。大约每千人中有5例发生，并可能导致严重的关节损伤和残疾[18]。目前在药物治疗方面，非甾体抗炎药或止痛药以及糖皮质激素类药物并不能阻止损伤的进展和不可逆转的残疾，而只改善症状，抗风湿药物(DMARDs)分为合成的(口服小化学分子)和生物的(非肠道注射的蛋白质)制剂，使用DMARDs治疗可以干预RA的体征和症状，改善身体功能，并抑制关节损伤进展[19]。但是每一种药物效价是有限的，研究表明，将近40%的类风湿性关节炎患者实现了低活动性，约20%的类风湿性关节炎患者得到缓解。且大多数生物DMARDs和靶向合成DMARDs都存在感染风险等副作用。除此之外，高昂的费用也限制了这些药物的使用[20]。所以需要寻找潜在的药物以改善RA疾病的进展。

具有抗氧化和抗炎性质的天然化合物可被用作治疗关节炎[21]。槲皮素是在水果、蔬菜、浆果和红茶中含量丰富的主要天然类黄酮化合物之一，已证实槲皮素具有抗癌、抗氧化和抗炎特性[22]。研究发现，在体外实验中槲皮素可以促使类风湿滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RA-FLSs)凋亡[23,24]，并抑制其增殖[25]。在大鼠CIA模型中，以150 mg/kg剂量经口给予槲皮素能够显著下调肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)[26]。在鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane，CAM)模型中槲皮素能够抑制血管新生[27]。研究还发现槲皮素可以抑制血管新生发挥抗肿瘤作用[28]。血管新生在RA发病机制中起到关键作用[3]。因此，靶向血管新生对RA治疗有很大的潜力。然而，对于槲皮素能否减缓RA血管新生进程的研究相对不足，所以该研究旨在明确槲皮素对于RA血管新生的影响，并进一步了解其作用机制和潜在的治疗靶点，以便有效地将槲皮素用于RA的治疗。

胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)与RA在临床发病以及病理表现方面存在较多相似的特征，是研究RA发病机制最常用的动物模型[29]。本研究中，大多数大鼠在初次免疫后约14 d出现CIA典型的足爪发红、肿胀(见图2)。而在槲皮素处理的大鼠中，观察到平均关节炎评分和足爪体积明显降低，从而关节炎的严重程度明显减弱。此外，关节组织病理学结果表明，槲皮素治疗可显著改善CIA大鼠关节的炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成、软骨和骨侵蚀(见图3)。这些病理变化是RA重要的特征表现。ELISA结果表明，槲皮素可以降低CIA大鼠关节滑膜中的细胞因子的释放，从而减轻关节炎症(见图6)。综合这些结果表明，槲皮素能够有效阻止CIA大鼠关节炎进展并降低关节炎的严重程度。

血管新生在RA中主要参与血管翳形成并维持滑膜的浸润[30]。本研究中，为了评估槲皮素产生抗血管新生作用，通过免疫组织化学对关节滑膜组织中用于可视化血管新生的标志物CD34进行染色。槲皮素治疗后，CIA大鼠关节滑膜组织中微血管密度显著降低(见图4)。这表明槲皮素能在CIA中发挥有效的抗血管新生作用。本文进一步探索槲皮素在CIA中发挥抗血管新生的的潜在机制。以往的体外和体内研究证实，血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)作为效果突出的促血管生成因子，在RA滑膜组织中高表达[5]。VEGFA结合其受体，通过一系列信号转导，对血管内皮细胞发挥特异性作用，包括释放多种生长因子和炎性因子，加速内皮细胞增殖和迁移，参与新血管的调节和生成，最终导致大量新生血管产生[31]。VEGFA在RA的发病机制中发挥重要作用[32]。VEGFA的表达下调可明显减轻血管生成以及滑膜炎症[33]。同时，RA关节缺氧环境与滑膜血管过度形成相互影响。低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)在缺氧条件下大量表达，可促进缺氧增加的炎性细胞因子的产生，促进血管生成、侵袭和转移[34]。研究表明，在CIA大鼠中抑制HIF-1α可减少大鼠关节炎症和血管生成[33]。本研究IHC与Western blotting实验结果均显示槲皮素在体内可以抑制CIA大鼠滑膜中VEGFA的表达。同时在IHC实验中还发现槲皮素可以抑制HIF-1α、CD34的表达(见图4)，而在Western blotting实验中CD34的表达没有明显变化(见图5)。

总之，本文结果表明，槲皮素可能通过下调HIF-1α和VEGFA的表达，在体内对RA产生抗血管新生作用。这些发现对槲皮素在RA发病机制中的作用的提供了进一步认识，并表明槲皮素可能是治疗RA的一种有潜力治疗药物。