陈丽娟,肖 泓*,兰成仲,杨彦斌,祁向荣,欧阳丽,张晓丽,王凤英,金其花,孙 毅

(1云南中医学院第一附属医院,云南省中医医院肺病科,昆明 650000;2云南中医学院第一附属医院,云南省中医医院泌尿科;*通讯作者,E-mail:xiaohong0575@163.com)

肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是一种慢性疾病,其特征是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度积聚,导致肺结构瘢痕和损伤,从而限制气体交换。最终,大多数PF患者死于不可逆转的肺功能恶化[1]。目前,PF在世界范围内的发病率逐渐增加,中位生存期约为3-5年[2]。因此,PF的治疗仍然是一个亟待解决的主要问题。研究显示肺泡上皮细胞在炎症、氧化应激以及某些细胞因子特别是转化生长因子-β1(TGF-β1)的刺激下逐渐失去紧密连接以及上皮表型E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等间充质表型,并沿着新分泌的Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)迁移,这个从上皮细胞向间充质细胞转变,由此产生成纤维细胞和肌成纤维细胞,分泌更多细胞外基质的过程即上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),研究已证实EMT是PF的重要病理过程[3,4]。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是导致细胞内质网生理功能紊乱的一种亚细胞器病理状态,其下游的效应器与内质网内的分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)发生解离,最终引起EMT和上皮细胞凋亡,在PF发病起始过程中起着至关重要的作用[5]。因此,针对EMT在PF形成过程中的重要性,是否可以影响EMT的过程,且可能通过诱导ERS的发生进而介导EMT的形成,可能会为PF的治疗提供一种有前途的策略。

益肺汤是在反复辨治肺痿患者取效的基础上,传承与创新后总结而成的,由炙桑白皮、白术、枳实、桃仁、丹参、桔梗、甘草组成,具有脏腑兼顾,宣降结合,气血同调,上下同治,攻补兼施之特点[6]。线粒体辅酶Q(mitoquinone,MitoQ)是新型线粒体靶向抗氧化剂,可作为一个重要的亲脂抗氧化剂,通过激活解偶联蛋白,减少自由基的生成,阻止自由基对蛋白质、脂质、DNA的氧化修饰[7]。PF过程中线粒体在氧化应激过程中压力过大后就会激活TGF-β1通路,同时NADPH氧化酶中NOX4过表达,进一步促进PF的过程[8],这可能是PF过程中最关键的过程之一,而通过MitoQ可能有效地逆转这一过程。然而,益肺汤联合MitoQ对TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞内EMT的直接影响尚不清楚。本研究旨在探讨益肺汤联合MitoQ对TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞内EMT的直接影响,并探讨其可能的分子机制,为PF的治疗及进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

HPAEpiC细胞株,购自上海桥杜生物科技有限公司。

1.2 主要试剂及仪器

益肺汤全部药材购于云南省中医医院药房;MitoQ(澳大利亚Antipodean Pharmaceuticals公司);TGF-β1人重组蛋白(批号:081735,美国Peprotech公司);DMEM培养基(批号:060711,美国Gibco公司);CCK-8试剂盒(Beyotime Technology,江苏);活性氧(ROS)测定试剂盒(批号:238240413,南京建成生物科技有限公司);RNA Trizol Reagent(批号:vs18061730,合肥博美生物科技有限公司生产);PrimeScript RT reagent Kit(货号:RR047A,宝日医生物技术有限公司生产);TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(货号:RR820A,宝日医生物技术有限公司生产);Western细胞裂解液(货号:P0013,Beyotime);BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号:P0009,Beyotime);ECL发光试剂盒(货号:KF001,Affinity);Immobilon-PSQ PVDF膜(货号:ISEQ00010,Sigmaaldrich);GRP78一抗(货号:ab21685,英国abcam-艾博抗(上海)贸易有限公司);实时荧光定量(RT-PCR)仪(型号PIKORed 96,美国ThermoFisher仪器有限公司生产);全功能酶标仪MK3(美国ThermoFisher仪器有限公司)。

1.3 益肺汤水煎液药物制备

益肺汤由炙桑白皮12 g、白术10 g、枳实12 g、桃仁12 g、丹参18 g、桔梗12 g、甘草6 g组成,取中药饮片置于电动煎药壶内,加入800 ml的矿泉水浸泡1 h,大火煮沸30 min,纱布过滤。药渣再加600 ml矿泉水继续煎煮,煮沸20 min,过滤。合并两次滤液,经旋转蒸发仪真空减压浓缩,浓缩至约生药含量3 g/ml的溶液,分装,-80 ℃冻存备用。

1.4 益肺汤含药血清制备

SD大鼠30只,6-8周,体质量约(200±20)g,购自四川大学华西医院实验动物中心,许可证号:SYXK(川)2018-119。适应性饲养1周后,随机将大鼠分为空白对照组和益肺汤组,每组15只。空白对照组大鼠灌胃生理盐水,益肺汤组大鼠每日灌服益肺汤水煎液(10 ml/kg,生药含量3 g/ml),每日1次。连续给药4周。末次给药1 h腹主动脉采血,离心,取上清,56 ℃水浴30 min灭活,0.22 μm微孔滤膜过滤,-20 ℃保存。按合适浓度加入细胞培养基。其中,MitoQ使用剂量参考陈胜利等[9]的报道,益肺汤水煎液使用剂量参考张伟等[10]和张文斌等[6]的报道。

1.5 细胞培养及实验分组

前期研究[11]报道浓度为10 ng/ml的TGF-β1能显著刺激肺上皮细胞增殖,5%益肺汤含药血清对细胞增殖有明显抑制作用,以此为依据建立细胞模型并给药。空白对照组:正常培养HPAEpiC细胞;模型组:10 ng/ml TGF-β1诱导;模型+MitoQ组:10 ng/ml TGF-β1诱导+0.1 μmol/L MitoQ;模型+益肺汤组:10 ng/ml TGF-β1诱导+益肺汤含药血清(5%含药血清);模型+MitoQ+益肺汤组:10 ng/ml TGF-β1诱导+0.1 μmol/L MitoQ+益肺汤含药血清(5%含药血清)。选对数生长期的细胞(HPAEpiC细胞),胰蛋白酶消化,制成细胞悬液,离心,弃上清,加入培养基(10% FBS)重悬细胞中板,培养(37 ℃、5% CO2)24 h后,加入无血清培养基饥饿12 h,加入10 ng/ml TGF-β1及含药血清,培养48 h后,收集细胞进行指标检测。

1.6 CCK-8检测细胞存活率

收集不同培养组细胞,使用细胞CCK-8试剂盒说明评估细胞增殖。将不同处理组细胞接种到96孔板(1×104细胞/孔)中,并设置空白组(无细胞),在37 ℃培养箱中培养24 h,培养结束前每孔加入10 μl CCK-8试剂后继续培养3 h,肉眼观察细胞孔中颜色由黄色变成深橙色,通过酶标仪在450 nm处测定吸光值。细胞存活率(%)=[(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

1.7 qRT-PCR检测细胞E-cadherin、Col Ⅰ、α-SMA mRNA表达

使用TRIzol试剂盒按照制造商说明从细胞中提取总RNA。逆转录合成cDNA用于qRT-PCR分析。使用SYBR PreMix Taq在ABI PRISM 7900热循环器上进行PCR扩增。引物序列见表1。以GAPDH为内参,qRT-PCR反应条件为:95 ℃初始变性10 min,随后95 ℃变性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,45个循环,记录Ct值,采用2-ΔΔCt分析基因相对表达水平。

表1 qRT-PCR中用于特异性mRNA扩增的引物序列

1.8 流式细胞术测定细胞内ROS水平

用二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)检测细胞内ROS的产生。收集不同处理组细胞接于EP管中,1 800 r/min离心5 min,弃掉上清液后,将细胞与1 ml的DCFH-DA溶液(10 μmol/L)在37 ℃避光孵育30 min。胰蛋白酶分离细胞,在4 ℃下1 800 r/min离心5 min。然后用PBS洗涤2次,放在冰上黑暗中保存,采用流式细胞仪488 nm激发光和525 nm发射光下检测ROS含量。以荧光强度或ROS含量高的细胞占总细胞的百分比表示ROS水平,每组实验重复3次。

1.9 Western blot检测GRP78蛋白表达水平

收集细胞用PBS洗涤3次,然后在RIPA缓冲液中用蛋白酶和磷酸酶抑制剂在冰上溶解10 min,蛋白质浓度用Bio-Rad蛋白质测定法测定,等量的蛋白质样品用12% SDS-PAGE分离,并转移到聚偏二氟化膜上,然后用5%脱脂牛奶封闭1 h。随后用一抗GRP78(稀释比1 ∶1 000)和β-catin(稀释比1 ∶2 000)4 ℃孵育过夜,随后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二级抗体(1 ∶3 000)室温孵育1 h。ECL暗室显色,显色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系统采集图像,Image-ProPlus分析光密度,以β-actin为内参,结果以目的蛋白相对表达量表示。目的蛋白相对表达量=目的蛋白积分光密度值(IOD)/内参积分光密度值(IOD)。实验重复3次。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 益肺汤联合MitoQ对TGF-β1诱导的HPAEpiC细胞存活率的影响

与空白对照组比较,药物作用48 h时,模型组TGF-β1诱导的HPAEpiC细胞存活率明显增加(P<0.01);与模型组比较,模型+MitoQ+益肺汤含药血清组培养48 h时对TGF-β1诱导的HPAEpiC细胞存活率具有明显抑制作用(P<0.05);药物作用24 h时,各组间细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05),结果说明MitoQ+益肺汤含药血清对TGF-β1诱导的细胞存活具有抑制作用(见表2)。

2.2 益肺汤联合MitoQ对TGF-β1诱导的HPAEpiC细胞E-cadherin、Col Ⅰ、α-SMA mRNA表达的影响

与空白对照组比较,模型组Col Ⅰ、α-SMA mRNA表达明显增加,E-cadherin mRNA表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,模型+益肺汤含药血清组和模型+MitoQ+益肺汤含药血清组Col Ⅰ、α-SMA mRNA表达明显降低,E-cadherin mRNA表达明显升高(P<0.05,见表3),表明MitoQ+益肺汤含药血清能有效地调控EMT过程,抑制细胞引起EMT。

表2 益肺汤联合MitoQ对细胞于24 h和48 h细胞存活率的影响

表3 益肺汤联合MitoQ对细胞中E-cadherin、ColⅠ、α-SMA mRNA表达的影响

2.3 益肺汤联合MitoQ对TGF-β1诱导的HPAEpiC细胞中ROS水平的影响

与空白对照组比较,模型组ROS荧光强度明显增加(P<0.01);与模型组比较,模型+MitoQ组、模型+益肺汤含药血清组、模型+MitoQ+益肺汤含药血清组ROS荧光强度均明显降低(P<0.01,见图1),表明MitoQ+益肺汤含药血清的保护作用可能是通过降低细胞内ROS水平实现的。

2.4 益肺汤联合MitoQ对TGF-β1诱导的HPAEpiC细胞中GRP78蛋白表达的影响

与空白对照组比较,模型组GRP78蛋白表达明显增加(P<0.05);与模型组比较,模型+MitoQ组、模型+益肺汤含药血清组、模型+MitoQ+益肺汤含药血清组GRP78蛋白表达均明显降低(P<0.05,见图2),表明MitoQ+益肺汤含药血清可抑制GRP78蛋白表达。

与空白对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01图1 益肺汤联合MitoQ对细胞中ROS水平的影响Figure 1 Effect of Yifei decoction combined with MitoQ on the level of ROS in cells

与空白对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05图2 益肺汤联合MitoQ对细胞中GRP78蛋白表达的影响Figure 2 Effect of Yifei decoction combined with MitoQ on GRP78 protein expression in cells

3 讨论

PF是一种严重的炎症性间质性肺疾病,其具有较高的发病率和死亡率,预后较差[12]。目前,除了肺移植,PF的进展和结果不能被其他特殊治疗有效地阻止[13]。探索治疗PF的新型药物仍是亟待解决的问题。EMT一直被认为是纤维化疾病的机制之一,在PF的发生发展中起着关键作用,由于TGF-β1是PF的主要诱导者,研究TGF-β1诱导的人肺泡上皮细胞HPAEpiC内细胞转化对理解PF的发病机制具有重要意义。本研究证明益肺汤联合MitoQ对TGF-β1诱导的人肺泡上皮细胞HPAEpiC间质转化的抑制作用,可能为肺泡上皮细胞转化相关疾病提供一种新的治疗方法。

PF的特点是成纤维细胞/肌成纤维细胞和细胞外基质在肺内过度堆积,破坏了其结构和功能[14]。虽然肺纤维化的发病机制尚不清楚,但肺上皮细胞,特别是Ⅱ型肺泡上皮细胞已被确定为该病的关键参与者之一。原代人Ⅱ型肺泡上皮细胞经历TGF-β1依赖的上皮细胞转化,从而获得产生胶原的能力,促进PF进展[15]。研究表明,益肺汤可以有效抑制PDGF表达,同时PDGF的表达可以影响下游的细胞因子网络从而干预TGF-β1通路影响肺纤维化过程[16]。此外,MitoQ通过抑制线粒体的活性氧的水平,减少线粒体的氧化损伤从而阻断因氧化应激而激活的TGF-β1通路和NOX4表达[17]。然而,益肺汤联合MitoQ对TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞间质转化的直接作用尚不确定,在本研究,我们发现益肺汤联合MitoQ明显抑制了TGF-β1诱导的HPAEpiC细胞增殖及EMT过程。E-cadherin的丢失被认为是EMT发病过程中的一个关键因子,可以与β-catenin相互作用,介导细胞黏附[18]。相应地,Col Ⅰ、α-SMA在TGF-β1刺激后均升高[19]。益肺汤联合MitoQ可抑制Col Ⅰ、α-SMA mRNA的表达,上调E-cadherin mRNA的表达,表明益肺汤联合MitoQ对EMT样细胞行为有抑制作用。以上结果提示益肺汤联合MitoQ的抗纤维化作用至少部分是由于其对TGF-β1介导的间质转化的干扰,因此抑制TGF-β1诱导的EMT参与了益肺汤联合MitoQ对PF的保护作用。

此外,ROS是氧化应激的主要参与因子,并通过改变包括血管内皮细胞在内的上皮细胞的基因表达、细胞骨架重排和细胞迁移而在TGF-β1诱导的上皮细胞转化中起重要作用[20]。当发生氧化剂/抗氧化剂失衡时,过量的ROS合成,导致包括EMT在内的一系列病理事件[21]。研究报道,穿心莲内酯可以显著抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的A549细胞内ROS的产生[22]。然而,目前尚不清楚益肺汤联合MitoQ是否介导了TGF-β1诱导的HPAEpiC细胞内膜转化中ROS的产生。本研究表明,益肺汤联合MitoQ明显减少了TGF-β1诱导的ROS的产生。提示益肺汤联合MitoQ可能通过抑制ROS途径抑制TGF-β1诱导的细胞间质转化。GRP78是一种广泛分布于内质网的分子伴侣,是主要的UPR调节因子,促进蛋白质折叠,防止蛋白质在内质网中聚集,稳定蛋白质构象,促进内质网折叠,是识别、保留和最终消除靶点的质量控制系统[23]。研究报道博莱霉素损伤后小鼠AT2细胞出现GRP78免疫反应[24]。内质网应激还可通过Smad2和Src途径诱导肺泡上皮细胞发生EMT[25]。本研究显示TGF-β1诱导HPAEpiC细胞GRP78蛋白表达明显增加,益肺汤联合MitoQ明显减少了TGF-β1诱导的GRP78蛋白表达。提示益肺汤联合MitoQ可抑制GRP78蛋白表达改善TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞转化。

综上所述,益肺汤联合MitoQ通过抑制TGF-β1激活的GRP78来减弱TGF-β1诱导的肺泡上皮HPAEpiC细胞间质转化。益肺汤联合MitoQ还可减少TGF-β1诱导的纤维化过程中ROS的产生。本研究认为益肺汤联合MitoQ是一种有前途的PF治疗策略。