邓 樱,唐润伟,卫 菊,乐 枫,刘云龙,钱耀明

(上海市第一人民医院中医外科,上海 200080)

乳腺癌(breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在逐年上升[1,2]。目前中医药是治疗乳腺癌的有效辅助手段,对于无法从常规肿瘤放化疗的治疗手段中获益的病人,中医药保守治疗是重要选择。中医认为乳腺癌的病因是内伤清志、痰瘀互结、正气亏虚,治疗以疏肝解郁、化痰散淤、调补气血为主[3]。黄芪、莪术是传统中医治疗乳腺癌的对症药物,中药黄芪有补气固表、托毒排脓、利尿、生肌的作用,莪术主治气血凝滞、心腹胀痛等疾病[4,5]。近年研究报道,黄芪与莪术通过参与肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和转移,以及抗血管生成等多种代谢机制影响肿瘤的生存与进展[6-8]。因此,本研究通过建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型,选用补气活血中药黄芪、莪术对乳腺癌移植瘤裸鼠进行治疗,观察治疗效果;且由于在前期研究当中我们发现黄芪注射液及其有效成分对乳腺癌细胞增殖和Akt磷酸化有一定的影响[9],猜测其对于乳腺癌细胞增殖抑制与PI3K-Akt信号通路密切相关,因此在本研究中我们重点关注黄芪、莪术对PI3K-Akt信号通路的影响,从而希望通过分子生物学角度探索黄芪、莪术联合治疗乳腺癌的机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及动物

人乳腺癌MDA-MB-231细胞,购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。MDA-MB-231细胞使用L15培养基(Leibovitz’s L-15 Medium,Thermo Fisher Scientific,USA)和10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,Thermo Fisher Scientific,USA)培养,每隔2 d传代一次。雌性SPF级裸鼠共18只,每组3只,周龄6-8周,购自中国科学院上海实验动物中心。

1.2 试剂与仪器

苏木素(上海展云化工有限公司),伊红(上海展云化工有限公司),4%多聚甲醛(无锡菩禾有限公司),PBS(无锡菩禾有限公司),中性树胶(中国上海懿洋仪器有限公司),TUNEL检测试剂盒(上海凯基有限公司KGA7033),0.25%胰蛋白酶(上海碧云天有限公司),Trizol(赛默飞世尔科技),DEPC处理水(无锡菩禾有限公司),SYBR Green PCR试剂盒(Thermo F-415XL),逆转录试剂盒(赛默飞世尔科技#K1622),BCA蛋白定量试剂盒(BIOSHARP生物科技公司),30%丙烯酰胺(29 ∶1)(上海国药集团化学试剂有限公司),1.5 mol/L Tris-HCl pH=8.8电泳缓冲液(上海国药集团化学试剂有限公司),1.0 mol/L Tris-HCl pH=6.8电泳缓冲液(上海国药集团化学试剂有限公司),10% SDS(上海国药集团化学试剂有限公司),10%过硫酸铵(SIGMA,美国),TEMED(SIGMA,美国),4×蛋白上样缓冲液(宝日生物技术有限公司),蛋白预染Marker(赛默飞世尔科技),5% BSA(BIOSHARP生物科技公司),Tween-20(Amresco Ltd,美国),发光液(Millipore,美国)。

1.3 实验仪器

游标卡尺,超净工作台(苏州安泰科技有限公司),光学显微镜(OLYMPUS,IX71,日本),低温冷冻离心机(Sigma Ltd,3K15,美国),ABI 7500 Fast Real-Time PCR system PCR仪(安捷伦有限公司,美国),PVDF膜(Millipore,美国),电泳仪(mini protean 3 cell,美国BIO-RAD有限公司),电转仪(PS-9,大连竞迈科技有限公司),酶标仪(赛默飞世尔科技,MK3),移液器(赛默飞世尔科技),一体式化学发光成像仪(上海勤翔科学仪器有限公司,Chemi Scope 5300 Pro)。

1.4 实验方法

1.4.1 药物制备 中药材均购买于中国中药有限公司。其中黄芪为豆科植物蒙古黄芪的根,产地为我国黑龙江省依兰县;莪术为姜科植物莪术的根茎,产地为我国广西壮族自治区。中药黄芪、莪术经过浸泡,用传统水煎法提取其中的有效成分,黄芪、莪术提取物浓度均为0.4 g/ml,根据动物公斤体质量剂量换算系数换算法:以临床实际用药剂量作为参考量,即黄芪、莪术均30 g,以成人标准体质量70 kg计算,根据鼠剂量=人剂量×9.01,即裸鼠剂量约为3 900 mg/kg,每只裸鼠按照20 g标准体质量计算,即单只小鼠的应用量为78 mg,取整80 mg,灌胃量定为0.2 ml。

1.4.2 模型建立及分组给药 在SPF环境下观察裸鼠1周,状况良好,准备接种细胞;75%酒精消毒裸鼠注射部位皮肤,在裸鼠右侧腋下注射含1.8×106个MDA-MB-231细胞的细胞悬液;刺入点距注射点约1 cm,形成一隆起皮丘,防止液体漏出。消毒皮肤,观察成瘤情况。数日后,当成瘤80 mm3左右开始灌胃给药,每只裸鼠每日1次,每组给药4周。之后将裸鼠称重,处死,取出移植瘤,称瘤重;计算抑瘤率。根据不同给药情况将试验裸鼠分为6组,比较黄芪、莪术单用和联用的抑制作用,并分析二者不同比例下抑制效应差异,为保证应用剂量的安全性,本研究以基础剂量(80 mg)的2倍进行不同比例的对照分析,故研究分组设计为:模型组、黄芪组、莪术组、黄芪莪术2 ∶1组(黄芪 ∶莪术浓度为0.8 g/ml ∶0.4 g/ml)、黄芪莪术1 ∶1组(黄芪 ∶莪术浓度为0.4 g/ml ∶0.4 g/ml)、黄芪莪术1 ∶2组(黄芪 ∶莪术浓度为0.4 g/ml ∶0.8 g/ml)。模型组给予等量的0.9%生理盐水。以黄芪莪术2 ∶1组为例,其中黄芪、莪术提取物浓度分别为0.8 g/ml和0.4 g/ml,其余组别以此类推。

1.4.3 HE染色检测黄芪-莪术对肿瘤组织形态学影响 取出裸鼠身上的人乳腺肿瘤,用病理切片机切片。用蒸馏水冲洗切片;滴加苏木素染色,染色5 min左右。蒸馏水洗至组织呈蓝紫色;滴加1%盐酸乙醇分化2 s,待组织变红;蒸馏水洗至组织呈蓝紫色;伊红染色,染色6 s;用蒸馏水冲洗切片;用无水乙醇脱水;滴加中性树胶,封片;镜下观察并拍照(×200)。

1.4.4 TUNEL检测黄芪-莪术对人乳腺癌细胞凋亡的影响 对石蜡包埋的乳腺肿瘤病理组织切片进行PBS冲洗。在切片上滴上100 μl含2 000 U的蛋白酶K反应液,在37 ℃室温放置20 min。滴加3% H2O2封闭,室温放置20 min。配制TdT酶反应液,即配即用;样本周围用吸水纸吸干,每个样本上滴加50 μl TdT酶反应液,放入湿盒中,37 ℃避光反应60 min;每个样本上滴加50 μl反应终止液,室温放置20 min;配制Streptavidin-HRP工作液,即配即用,避光保存;1×PBS漂洗切片3次;样本周围用吸水纸吸干,每个样本滴加50 μl DAB显色液,室温放置5 min;苏木素复染5 min,蒸馏水冲洗后浸入1%的盐酸甲醇分化5 s,立即用蒸馏水冲洗,分别用70%,85%,95%的酒精脱水,用二甲苯浸2次,每次10 min,晾干后封片。在光学显微镜下观察、拍照。每组随机选择并统计3个视野下凋亡细胞数量,进行计量分析。

1.4.5 RT-PCR检测PI3K-Akt通路以及抑癌基因PTEN mRNA水平 将乳腺肿瘤组织剪碎,Trizol裂解液法提取RNA。配置反转录反应体系:5×逆转录buffer 4 μl,RNA酶抑制剂1 μl,下游通用引物1 μl,dNTPs 1 μl,逆转录酶MMLV 1 μl,DEPC处理水8 μl,RNA模板4 μl,总体积20 μl。利用以上反应体系在反应条件为42℃ 40 min;85 ℃ 5 min逆转录RNA成cDNA。将制备好的cDNA进行PCR扩增,扩增体系如下:SYBR Green Mix 10 μl,上游引物0.4 μl,下游引物0.4 μl,ddH2O 7.2 μl,cDNA模板2 μl,总体积20 μl。扩增条件:94 ℃ 10 min,(94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s)40个循环。用ABI Prism 7500 SDS Software软件进行数据分析。引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.4.6 Western blot检测PI3K-Akt通路以及抑癌基因PTEN蛋白水平 将乳腺肿瘤组织剪碎后加入适量的RIPA裂解液,加入适量的PMSF,置于冰上裂解25 min;12 000 r/min,4 ℃,离心10 min。制备蛋白样品,进行SDS-PAGE,转膜后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h,孵育一抗4 ℃孵育过夜。一抗为:p-AKT(1 ∶5 000,anti-mouse,Proteintech),PTEN(1 ∶1 000,anti-rabbit,Proteintech),GAPDH(1 ∶5 000,anti-mouse,Proteintech)。孵育一抗后的膜用TBST洗涤,按1 ∶5 000稀释二抗并在37 ℃孵育膜1 h。用TBST洗涤。二抗为:山羊抗小鼠(中杉金桥)和山羊抗兔(中杉金桥)。发光液(A液、B液)1 ∶1配置,用移液器吸取合适量的发光液至PVDF膜,在ECL发光仪上曝光并采集图像。

1.5 统计学方法

采用Graphpad Prism 8和SPSS 19.0统计软件进行数据处理。每个试验重复3次,最终数值以平均数±标准差表示。两组间比较采用t检验,多组间比较用单因素方差分析,多组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪-莪术对裸鼠乳腺肿瘤生长的抑制作用

裸鼠成瘤结果显示,黄芪和莪术介入后瘤块体积显著小于模型组(P<0.05,见表2),黄芪组肿瘤体积小于莪术组,两种药物以不同比例混合给药后,瘤块体积进一步缩小(P<0.05,见表2,图1,2),其中黄芪莪术2 ∶1组的肿瘤体积最小,抑瘤率最大,为82.7%。6个组的肿瘤体积都呈上升趋势,肿瘤体积增长最多,从植入乳腺癌MDA-MB-231细胞第7天到第49天,肿瘤体积从零增加到(3 140.33±149.9)mm3。6个组的肿瘤增长由快到慢的顺序是:模型组>莪术组>黄芪组>黄芪莪术1 ∶2组>黄芪莪术1 ∶1组>黄芪莪术2 ∶1组。

表2 各组裸鼠成瘤抑制率

2.2 黄芪-莪术对乳腺肿瘤细胞凋亡的影响

HE染色可见各组细胞核内的染色质与胞质内的核糖体呈蓝紫色,而细胞质和细胞外基质中的成分呈红色。HE结果显示,黄芪组和莪术组肿瘤细胞排列松散,收缩成圆形;两种药物混合组瘤块细胞排列更疏松,坏死更严重。其中黄芪莪术2 ∶1组乳腺肿瘤细胞排列最松散(见图3)。黄芪组的肿瘤细胞排列比莪术组松散。6组肿瘤细胞排列松散程度由高到低的顺序是:黄芪莪术2 ∶1组>黄芪莪术1 ∶1组>黄芪莪术1 ∶2组>莪术组>黄芪组>模型组。

与模型组比较,*P<0.05;与莪术组相比,#P<0.05;与黄芪莪术1 ∶1组比较,&P<0.05图2 黄芪-莪术对裸鼠乳腺癌成瘤体积的影响Figure 2 The effect of Huangqi and Ezhu on tumor volume in breast cancer nude mice

图3 黄芪莪术组对乳腺癌肿瘤组织的形态学影响 (HE×200,bar=20 μm)Figure 3 The morphology of Huangqi and Ezhu in breast tumor tissue (HE×200,bar=20 μm)

TUNEL检测试剂盒能对处在凋亡期具有断裂DNA的细胞进行染色。从TUNEL结果来看,黄芪组和莪术组肿瘤细胞凋亡个数显著高于模型组;两种药物混合给药组肿瘤细胞凋亡个数进一步增加,其中黄芪莪术2 ∶1组的乳腺肿瘤细胞凋亡个数最多,而莪术组肿瘤细胞凋亡个数略小于黄芪组(见图4和表3)。6组细胞凋亡个数由多到少的顺序是:黄芪莪术2 ∶1组>黄芪莪术1 ∶1组>黄芪莪术1 ∶2组>黄芪组>莪术组。

与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;与莪术组相比,#P<0.05;与黄芪莪术1 ∶1组比较,&P<0.05图4 黄芪莪术对乳腺肿瘤细胞凋亡的影响 (TUNEL,×100)Figure 4 Effect of Huangqi and Ezhu on breast tumor cell apoptosis (TUNEL,×100)

表3 各组乳腺癌肿瘤细胞凋亡情况

2.3 黄芪-莪术对PI3K-Akt通路和PTEN基因表达水平的影响

RT-PCR实验结果显示,与模型组相比,黄芪组、莪术组PI3K、Akt1、Akt2表达量显著降低,PTEN表达量显著升高;黄芪莪术混合组的PI3K、Akt1、Akt2表达量降低更为显著,PTEN表达量升高也更为显著。其中,黄芪莪术2 ∶1组PI3K、Akt1和Akt2基因表达水平相对于模型组降低的最多,PTEN基因表达水平相对于模型组升高的最多。6组乳腺肿瘤基因PI3K、Akt1、Akt2的表达水平由高到低的顺序是:模型组>莪术组>黄芪组>黄芪莪术1 ∶2组>黄芪莪术1 ∶1组>黄芪莪术2 ∶1组(见图5,表4)。而PTEN基因的表达水平由高到低的顺序是:黄芪莪术2 ∶1组>黄芪莪术1 ∶1组>黄芪莪术1 ∶2组>黄芪组>莪术组>模型组(见图5,表4)。

Western blot结果显示,黄芪莪术2 ∶1组的p-Akt基因的表达水平相对于模型组降低的最多,PTEN基因的表达水平相对于模型组升高的最多(见图6)。6组p-Akt的表达水平由高到低的顺序是:模型组>莪术组>黄芪组>黄芪莪术1 ∶2组>黄芪莪术1 ∶1组>黄芪莪术2 ∶1组。6组PTEN的表达水平由高到低的顺序是:黄芪莪术2 ∶1组>黄芪莪术1 ∶1组>黄芪莪术1 ∶2组>黄芪组>莪术组>模型组(见图6,表5)。

与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01图5 RT-PCR检测乳腺癌肿瘤细胞中PI3K、Akt1、Akt2和PTEN基因的表达水平Figure 5 The expression levels of PI3K,Akt1,Akt2 and PTEN in breast cancer cell by RT-PCR assay

表4 RT-PCR检测各组乳腺肿瘤细胞中PI3K、Akt1、Akt2和PTEN基因的mRNA表达水平

与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01图6 Western Blot检测乳腺癌肿瘤细胞中p-Akt和PTEN的蛋白表达水平Figure 6 Protein levels of p-Akt and PTEN in breast cancer cells by Western Blot

表5 Western Blot检测乳腺肿瘤细胞中p-Akt和PTEN的蛋白表达水平

3 讨论

随着科技和社会的发展,人们生活和工作压力的增加,乳腺癌的发病率逐渐升高,现在已成为仅次于宫颈癌的女性第二大癌症。乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下,发生增殖失控的现象[10]。早期乳腺癌常表现为乳房肿块、乳头溢液、腋窝淋巴结肿大等症状。晚期乳腺癌可发生癌细胞远处转移,出现多器官病变,威胁患者生命[11]。中医对乳房肿块的诊断是局部气血淤积,通路不畅[12]。早期乳腺癌的初步治疗是心情、生活方式调整治疗,配合化学药物治疗、靶向药物治疗、内分泌药物治疗;如果得不到缓解或就诊时经专家会诊建议手术治疗,则应手术治疗,术后辅助药物治疗或放射治疗[13,14]。

黄芪、莪术是治疗乳腺癌的中药复方癌复康的关键配伍药物,具有益气补血、消肿化瘀、抗癌解毒的功效,能显著改善乳腺癌患者术后化疗的生存质量[15]。宋魏等[16]对黄芪解毒方对胃癌SGC-7901细胞的作用进行了研究,得出黄芪解毒方能有效抑制胃癌SGC-7901细胞增殖,促进其凋亡,并能下调C-myc基因的表达。臧文华等[17]对黄芪、莪术联合顺铂治疗人肝癌裸鼠模型进行了研究,得到黄芪、莪术配伍能下调TF、HGF、FVII基因的表达,对肿瘤新生血管生成有抑制作用。姚远等[18]对黄芪、莪术不同提取物治疗肝癌进行研究,得出黄芪-莪术95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、传统水煎4种提取物均能抑制小鼠H22荷瘤生长。

我们前期研究发现,黄芪注射液及其有效成分可能通过下调Akt磷酸化从而抑制乳腺癌细胞增殖[19]。本研究结果显示,黄芪、莪术对乳腺癌细胞裸鼠成瘤都有显著的抑制作用。而黄芪对乳腺肿瘤的消除能力大于莪术,并且对促癌PI3K/Akt信号通路的抑制作用显著优于莪术。但是黄芪-莪术联合给药对乳腺癌的抑制能力增强,明显大于黄芪、莪术单独给药。且在调整黄芪莪术联合浓度为2 ∶1时,肿瘤体积最小,促进乳腺肿瘤细胞凋亡,PI3K、Akt1和Akt2基因表达水平相对于模型组降低幅度最大,抑癌基因PTEN基因表达水平相对于模型组升高的最多。这说明黄芪 ∶莪术浓度为2 ∶1时,对乳腺癌的抑制最强,在配伍时应该按照此比例,黄芪是主要治疗药物。黄芪莪术2 ∶1组乳腺肿瘤细胞排列最松散。说明黄芪的作用很可能是切断肿瘤细胞之间的联系,使细胞膜之间的黏附性降低。而莪术的作用需要后续深入研究。

目前有多项研究表明磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路的异常活化能促进乳腺癌细胞的增殖和迁移,抑制癌细胞的凋亡[19]。激活PI3K能促使质膜上产生的第二信使PIP3与含有PH结构域的信号蛋白Akt和PDK1结合,促进PDK1磷酸化Akt蛋白的Ser308,使得Akt活化。活化的Akt能通过磷酸化作用激活或抑制其下游的靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27Kip1等,从而调节细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等,引发癌症[20,21]。PTEN是一个PIP3-磷酸酶,它的功能与PI3K相反。PTEN能通过去磷酸化将PIP3转化为PI-4,5-P2,从而减少Akt的活化,阻止所有由Akt调控的下游信号的传导,抑制PI3K-Akt信号通路[22]。

我们的研究将黄芪、莪术对乳腺癌的治疗作用与PI3K/Akt信号通路联系起来,黄芪、莪术的提取物对PI3K/Akt通路有显著抑制作用,并能促进PTEN基因的表达,从而抑制关键因子PIP3,阻断PI3K/Akt通路向下游传导。但对于黄芪、莪术联合给药是否抑制了PI3K/Akt通路中的其他因子及其具体机制,以及对乳腺癌的其他相关信号通路的抑制作用及其机制仍有待研究。黄芪、莪术联合给药对乳腺癌的抑制作用最强的绝对比例仍有待继续探究,但我们的研究中2 ∶1的比例较优,应在未来研究中对比例进行细化。

黄芪、莪术因具有散瘀疏气的作用而对肿瘤有一定的疗效。在黄芪:莪术浓度为2:1时,对乳腺癌的治疗效果最好,并且其对乳腺癌的治疗作用很可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路,并激活PTEN基因而达到的。在乳腺癌的辅助治疗中,可以用中药黄芪莪术2 ∶1进行配伍治疗。