刘斯晗 郑旭阳 钟川 王鹏 阳燕娟 于文进

摘要：【目的】鑒定分析嫁接番茄根系分泌物，研究其活性成分对番茄抗青枯病、番茄体内青枯菌及根际微生物数量的影响，为番茄青枯病的防治提供新思路。【方法】以高感青枯病番茄品种粉贝贝（Fb）、高抗青枯病番茄砧木番砧  1号（No.1）和茄砧21号（No.21）为试验材料，设自根嫁接（Fb/Fb）、砧穗嫁接（Fb/No.1、Fb/No.21）和砧木自嫁接（No.1/No.1、No.21/No.21）5个嫁接组合。利用气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）对嫁接番茄接种青枯菌前后的根系分泌物进行鉴定分析，用筛选出的活性物质对高感病番茄进行灌根处理后接种青枯菌，采用稀释平板法分离测定番茄体内和根际青枯菌及根际微生物数量。【结果】从嫁接番茄根系分泌物中鉴定筛选出邻苯二甲酸二甲酯（DP）和2，6-二叔丁基对甲苯酚（BHT）2种活性物质，其中1.0 mmol/L DP与1.0 mmol/L BHT混合灌根处理的抗青枯病效果最好，使高感病番茄的青枯病发病率和病情指数显著降至46.7%、42.5（P<0.05，下同）。2种活性物质灌根处理均能使根际微生物总量和细菌数量明显下降;均可降低根际真菌数量，其中BHT的抑制效果更强;均可在发病初期显著抑制放线菌的增殖，且DP的抑制效果强于BHT。【结论】筛选出DP和BHT 2种活性物质，其可通过改善根际微环境、降低植株体内和根际的青枯菌数量而提高番茄对青枯病的抗性。

关键词： 番茄;嫁接;青枯病;根系分泌物;气相色谱—质谱联用;根际微生物

中图分类号： S436.412.15                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）12-3382-10

Effects of active substances secreted from roots of two grafted tomato plants on tomato bacterial wilt and rhizosphere microorganisms

LIU Si-han， ZHENG Xu-yang， ZHONG Chuan， WANG Peng，

YANG Yan-juan， YU Wen-jin*

（College of Agriculture， Guangxi University， Nanning  530004， China）

Abstract：【Objective】The purpose of this study was to identify and analyze the root exudates of grafted tomato， and to study the effect of its active components on tomato resistance to bacterial wilt， bacterial wilt bacteria in tomato and the number of rhizosphere microorganisms， so as to provide new ideas for the control of tomato bacterial wilt. 【Method】Tomato varieties with high susceptibility to bacterial wilt disease， Fanbei （Fb）， tomato rootstocks with high resistance to bacterial wilt， Fanzhen No.1 （No.1） and Qiezhen No.21 （No.21） were used as experimental materials. There were five grafting combinations， which wereself-root grafting seedling （Fb/Fb）， rootstock grafting （Fb/No.1， Fb/No.21） and rootstock self-grafting （No.1/No.1， No.21/No.21）. Gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was used to identify and analyze the root exudates before and after inoculation of Ralstonia solanacearum in grafted tomatoes. Hypersusceptible tomatoes roots were treated with selected active substances then were inoculated by R. solanacearum. The dilution plate method was used to isolate and determine the amount of R. solanacearum and rhizosphere microorganisms in tomato and rhizosphere. 【Result】Two active substances， dimethyl phthalate （DP） and 2，6-di-tert-butyl-p-cresol （BHT）， were identified and screened from the root exudates of grafted tomato， among which 1.0 mmol/L DP and 1.0 mmol/L BHT mixed root irrigation treatment had the best disease resistance effect， which significantly reduced the incidence and di-sease index of bacterial wilt in highly susceptible tomato to 46.7% and 42.5 （P<0.05， the same below）. The two active substances in the root irrigation treatment significantly decreased the number of rhizosphere microorganisms and bacteria， both could reduce the number of rhizosphere fungi， in which BHT inhibition was more effective. They could both significantly inhibited number of fungiin the early stage of disease， and DP had better effects than BHT. 【Conclusion】Two active substances， DP and BHT， are screened out， which can improve the resistance of tomato to bacterial wilt by improving the rhizosphere microenvironment and reducing the number of bacterial wilt bacteria in the plant and in the rhizosphere.

Key words： tomato;grafting; bacterial wilt;root exudates;gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）;soil microorganism

Foundation items： National Natural Science Foundation of China（31660568）; Guangxi Science and Technology Major Special Project（Guike AA17204039-2， Guike AA17204026-1）

0 引言

【研究意义】番茄青枯病是我国华南地区番茄生产最严重的土传病害之一，采用抗病砧木嫁接可显著提高番茄对青枯病的抗性（王岳霞等，2018）。研究表明，用抗病砧木嫁接的番茄植株的根系分泌物具有抑制根际土壤中青枯菌侵染和繁殖的作用（赵文宗，2019）。然而，目前关于番茄嫁接植株根系分泌物的物质成分和含量，以及根系分泌物对嫁接植株的青枯病抗性及作用机理尚不明确。植物在生长过程中根系会向外部释放一些无机离子和有机化合物来调节植株自身生长和影响土壤及土壤微生物，这类由根系释放的物质统称为根系分泌物（李争艳等，2021）。根系分泌物的物质组成及含量与植株的种类和生长情况、根际受生物或非生物胁迫等因素息息相关（高游慧等，2021）。根系分泌物的不同组分对土壤结构形成、土壤养分活化、植物养分吸收和环境胁迫缓解等具有不同的作用（任改弟等，2021）。土壤中聚居有益微生物和病原微生物，植物可通过调节土壤微生物来增强自身的营养吸收与利用，或是增强自身的抗病能力。根系分泌物含有丰富的酸、醇和维生素等物质，是植物调节土壤微生物的重要媒介，为根际微生物的物质代谢和能量循环提供原料，从而影响土壤微生物的种类和数量在根际的分布（李慧等，2021）。植物根系分泌物对土壤微生物的调节和影响作为植株抗病性调节的一部分，被越来越多的研究者们所重视。研究嫁接番茄根系分泌物与土壤微生物的关系，有助于进一步揭示抗病砧木嫁接提高番茄青枯病抗性的机理。【前人研究进展】目前对番茄青枯病的防治主要集中于生物防治、农业防治和化学防治三大类（王杰等，2020）。农业防治成本高，周期长;化学防治对环境危害大。目前生物防治是青枯病防治的研究热点，其中新型植物源活性物质是重要的方向之一。研究表明，柑橘果肉和海绵组织中可萃取得到生物杀伤性产品Citrofresh，对番茄青枯病的田间防治有极强的效果（曾军，2012）;大蒜乙酸乙酯提取物对番茄青枯病菌具有很好的抑制效果（张万萍和赵丽，2012）。大量的研究结果表明，植株可通过根系分泌物直接抑制病原菌的生长，提高植株的抗病能力（李佳佳等，2020;袁仁文等，2020）。刘娜等（2013）发现茄子根系分泌物中的月桂醇和2，6-二叔丁基苯醌等物质可抑制黄萎病菌的菌丝生长，从而提高茄子对黄萎病的抗性;姜野（2017）发现西瓜根系分泌物中的棕榈酸可抑制西瓜转化型尖孢镰刀菌的生长繁殖，从而降低西瓜枯萎病的发病率。根系分泌物是植物与土壤及土壤微生物相互作用的主要途径（刘京伟等，2021），植物可通过根系分泌物调节土壤微环境，从而提高植株的抗病能力（申建波和毛达如，2011）。刘明（2015）研究发现，成熟期抗病转基因玉米与普通玉米的土壤细菌数量和真菌数量存在显著差异，可能与转基因玉米抗性提升有关;采用茄科蔬菜轮作可有效降低高发枯萎病蕉园土壤中的真菌数量，提高细菌和放线菌数量，从而提高香蕉对枯萎病的抗性（李梦辉，2017）;Boubaker等（2017）研究发现，番茄植株被灰霉病菌感染后根系分泌物中的葡萄糖酸水平升高，促进病原菌拮抗菌的生长，从而增强植株的抗病性;Yuan等（2018）发现香蕉根系分泌物中的有机酸能诱导有益菌增殖和生物膜形成，认为酚酸类物质含量增高潜在地增强了有益菌在根际的定殖和对病原体的抑制能力。本课题组前期研究发现，嫁接番茄根系分泌物能通过提高根际有益微生物的丰度和抑制病原菌增殖来提高番茄植株的抗病性（赵文宗，2019）。【本研究切入点】本课题组前期研究利用乙酸乙酯、石油醚和二氯甲烷等3种有机溶剂从嫁接番茄根系分泌物中鉴定出邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异辛酯和2，4-二叔丁基苯酚3种具有抗青枯病作用的活性成分（赵文宗，2019），嫁接番茄根系分泌物中是否还存在其他抗青枯病活性成分、活性物质对根际微生物种类和数量的影响等有待进一步探究。【拟解决的关键问题】利用气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）测定分析不同嫁接番茄处理接种青枯菌前后的根系分泌物，筛选出其中的主要活性物质，研究活性物质对番茄青枯病的防控效果，并通过稀释培养法探讨活性物质对番茄体内和根际微生物及病原菌的影响，为番茄青枯病的防治提供新思路。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验用嫁接砧木为高抗青枯病的番砧1号（No.1）和茄砧21号（No.21），接穗为高感青枯病番茄品种粉贝贝（Fb），均为本课题组选育的品种。青枯病病原菌（简称青枯菌）为本课题组从大田病株中分离保存的强致病性菌株（生理小种Ⅰ）。

培养基：细菌分离用牛肉膏蛋白胨培养基（NA）、真菌分离用马丁氏培养基、放线菌分离用改良高氏1号培养基。青枯菌用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）培养基进行分离培养。

1. 2 試验方法

1. 2. 1 试验设计 试验于2020年5—10月在广西大学农学院蔬菜温室和人工气候室中进行。砧木和接穗苗期管理相同，当砧木长至3叶1心时用C型套管贴接法嫁接，共设自根嫁接（Fb/Fb）、砧穗嫁接（Fb/No.1、Fb/No.21）和砧木自嫁接（No.1/No.1、No.21/No.21）5个嫁接组合。嫁接成活后移栽至营养钵中培养。嫁接植株长至现蕾期时，各嫁接组合取30株番茄苗，用伤根灌注法接种浓度为5×108 CFU/mL的青枯菌液，每株15 mL，以无菌水为对照。接种后置于人工气候室内，用于后续试验。

1. 2. 2 根系分泌物收集 每种嫁接苗接种青枯菌前后各处理取长势一致的10株单株，抖除植株根系大块基质，依次用清水和去离子水洗掉根上附着的杂质，用无菌纱布将植株根系吸干后置于装有500 mL去离子水的遮光烧杯内，连续通气培养24 h，杯内液体即为根系分泌物粗收集液。收集液经定性滤纸过滤杂质后，用去离子水定容至0.05 g/mL（每毫升收集液中含0.05 g鲜根重的根系分泌物），保存于4 ℃冰箱中备用。试验重复3次。

1. 2. 3 根系分泌物GC-MS分析 采用赵文宗（2019）的方法，以500 mL的乙醚作为萃取剂，按体积比1∶1对根系分泌物收集液进行萃取。利用GC-MS（Agilent 7890A-5975C）对乙醚萃取的根系分泌物组分进行分析。根据总离子流图，通过检索对比谱图库NIST08分析各组分中所含物质，采用峰面积归一法确定各物质的相对含量。通过比较不同嫁接组合根系分泌物萃取组分中各物质的相对含量差异，分析得出可能抑制番茄青枯病的主要活性物质。

1. 2. 4 根系分泌物主要活性物质防治青枯病试验

培育高感青枯病番茄幼苗，长至3叶1心时移栽至营养钵中培养7 d，用疑似根系分泌物中抑制番茄青枯病的活性物质（DP和BHT）进行灌根处理，随后接种青枯菌，验证疑似活性物质对青枯病的防治效果。

活性物质分别设0.2、0.5、1.0和2.0 mmol/L 4个浓度进行单因素试验，2种活性物质以0.2、0.5和1.0 mmol/L 3个浓度相互组合设9个双因素处理[DP+BHT的浓度配比分别设为（mmol/L）：A（0.2+0.2）;B（0.2+0.5）;C（0.2+1.0）;D（0.5+0.2）;E（0.5+0.5）;F（0.5+1.0）;G（1.0+0.2）;H（1.0+0.5）;I（1.0+1.0）]，每处理90株番茄幼苗，试验重复3次。每株灌根20 mL溶液，每3 d灌根1次，连续3次，以无菌水为对照（CK）。灌根结束7 d后，用伤根灌注法接种浓度为5×108 CFU/mL的青枯菌液，每株15 mL。接种青枯菌后14 d，调查番茄植株的发病率和单株病级，计算病情指数。

番茄青枯病的病情分级参考赵文宗（2019）的方法分为5级：0级，无症状;1级，1片叶萎蔫;2级，2～3片叶萎蔫;3级，除植株顶部2～3片叶外，其他叶片均萎蔫;4级，全株叶片萎蔫，植株死亡。

发病率（%）=发病株数/接种总株数×100

病情指数=∑（病情级别×该病级株数）/（病情最

高级别×接种总株数）×100

1. 2. 5 番茄植株体内及根际微生物数量测定 根际基质取样：分别在接种青枯菌前（S1）和青枯病发病初期（S2）、发病高峰期（S3）、发病末期（S4）取样。将番茄植株连同基质团从营养钵倒出，去掉表面1 cm深的基质，抖落松散基质露出根系，用毛刷取距根表4 mm内的基质作为根际基质。根际基质样品过10目筛后装入50 mL的无菌离心管中，置于-20 ℃冰箱备用。每处理随机取10株，重复3次。

植株取样：将各时期取样的植株剪除主茎0.5 cm以上部分，用去离子水洗净植株根系附着的基质，无菌水冲洗植株根系和主茎，无菌纱布吸干，取根系和主茎各10 g保存于-20 ℃冰箱备用。

微生物培养悬浮液制备：分别取10 g样品（主茎和根系样品经研磨）放入加有90 mL无菌水的锥形瓶中，密封后置于水平恒温摇床上30 ℃下200 r/min振荡30 min，获得悬浮液，将其进行梯度稀释，用于微生物分离培养。

微生物分离计数：参照赵文宗等（2019）的方法，采用稀释平板法分离培养根际基质中的细菌、真菌、放线菌及植株主茎和根系内的青枯菌。

取稀释至10-3、10-4和10-5的根际基质及植株主茎和根系悬浮液分别均匀涂布在不同分离培养基上，每处理涂3皿，每皿涂50 ?L，于28 ℃恒温黑暗条件下分别培养2 d（细菌和青枯菌）、3 d（真菌）、6 d（放线菌），记录每皿的菌落数，换算成每克鲜基质、鲜组织（主茎和根系）的菌落平均数，微生物总量为细菌、真菌和放线菌的菌落数量之和。

微生物数量（CFU/g）=（菌落平均数×稀释倍数）/

[每皿涂样量×鲜基质（或鲜

组织）重]

1. 3 统计分析

采用Excel 2010及SPSS 20.0对试验数据进行方差分析、图表绘制等处理。

2 结果与分析

2. 1 番茄嫁接苗根系分泌物的物质组成

通过GC-MS检测嫁接番茄根系分泌物的乙醚萃取组分，分析出烃类、酚类、酯类、醇类、酮类和萘胺类等多种物质成分，其中酚类物质占比为75.47%～83.89%，脂类物质占比为4.92%～12.17%（表1）。相对含量较高的有2，6-二叔丁基对甲苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、十八烷和1-十六烯等物质。其中2，6-二叔丁基对甲苯酚（BHT）在2种砧穗嫁接苗（Fb/No.1、Fb/No.21）中的含量比自根嫁接苗（Fb/Fb）高;邻苯二甲酸二甲酯（DP）在接种青枯菌后的2种砧穗嫁接苗中的含量比自根嫁接苗（Fb/Fb）高;2，4-二叔丁基苯酚和邻苯二甲酸二丁酯的含量在2种砧穗嫁接苗接种青枯菌后升高，推测这4种物质可能与嫁接番茄抗青枯病有关。本课题组前期研究（赵文宗，2019）已验证邻苯二甲酸二丁酯和2，4-二叔丁基苯酚具有防治青枯病的作用，因此本研究对DP和BHT的防治青枯病效果进行验证。

2. 2 2种活性物质对番茄青枯病的防治效果

使用不同浓度的DP和BHT灌根处理后，高感青枯病番茄的抗病性增强，随着处理浓度的提高，防病效果显著提高（P<0.05，下同）。DP处理下，低浓度0.2和0.5 mmol/L處理的发病率及病情指数均与CK无显著差异（P>0.05，下同），1.0和2.0 mmol/L处理的发病率及病情指数均显著低于CK，其中2.0 mmol/L处理的效果最好，发病率和病情指数分别降至57.7%、48.9（图1）。BHT处理下，低浓度0.2和0.5 mmol/L处理的发病率及病情指数与CK差异不显著，而1.0和2.0 mmol/L处理的发病率及病情指数显著低于CK和低浓度处理，其中2.0 mmol/L处理的发病率和病情指数最低，分别为74.4%和64.4（图2）。表明2种活性物质灌根处理均能提高番茄植株对青枯病的抗性，其中2.0 mmol/L处理的防病效果最好。

由图3可知，2种活性物质适宜浓度混合灌根处理的防病效果较单一物质处理好，其中1.0 mmol/L DP+1.0 mmol/L BHT混合处理（I）使青枯病发病率降至46.7%，病情指数降至42.5，显著低于其他处理，防病效果最好。

2. 3 2种活性物质对番茄根際和植株体内青枯菌数量的影响

在各发病时期，2种活性物质灌根处理的番茄根际、根系和主茎的青枯菌数量均低于CK，处理浓度越高，青枯菌数量越少（图4）。

各处理番茄根际青枯菌数量随着植株病期发展呈先升高后降低的趋势，发病初期的青枯菌数量最高，发病末期趋于平稳（图4-A）。发病初期，除0.2 mmol/L DP和0.2 mmol/L BHT处理外，其余各处理的根际青枯菌数量均显著低于CK，1.0 mmol/L DP处理的根际青枯菌数量最少，为55.625×105 CFU/g，其次为1.0 mmol/L BHT处理，根际青枯菌数量为62.126×105 CFU/g;发病高峰期，各处理根际的青枯菌数量较发病初期明显下降;发病末期，各处理的根际青枯菌数量与发病高峰期相比无明显变化。

各处理根系中的青枯菌数量少于根际，且变化趋势与根际存在差异，在发病高峰期青枯菌数量达到峰值（图4-B）。发病初期，0.5、1.0 mmol/L的DP和BHT处理的根系青枯菌数量显著低于CK，其余处理与CK差异不显著，其中1.0 mmol/L DP处理的根系青枯菌数量最少，为16.875×105 CFU/g;发病高峰期，各处理的根系青枯菌数量较发病初期明显增加，除0.2 mmol/L的DP和BHT处理外，其余处理的青枯菌数量均显著低于CK，1.0 mmol/L DP处理的根系青枯菌数量最少，为22.375×105 CFU/g，显著低于其他处理;发病末期，除1.0 mmol/L DP处理外，其余处理的根系青枯菌数量较发病高峰期明显下降。

主茎中的青枯菌数量少于根系，且变化趋势与根系相似（图4-C）。发病初期，除0.2 mmol/L的DP和BHT处理外，其余处理的青枯菌数量均显著低于CK;发病高峰期，0.2 mmol/L的DP和BHT处理的青枯菌数量较发病初期明显增加，其余处理无明显变化且显著低于CK;发病末期，0.2 mmol/L的DP和BHT处理及0.5 mmol/L BHT处理的青枯菌数量较发病高峰期明显下降，其余处理无明显变化，0.5和1.0 mmol/L的DP及BHT处理的青枯菌数量显著低于CK。

以上结果说明，在接种青枯菌条件下，2种活性物质处理的植株体内青枯菌数量均低于无菌水处理（CK），且青枯菌数量随着处理浓度的提高而下降，相同浓度的DP与BHT处理相比，DP处理的青枯菌数量更少。

2. 4 2种活性物质对根际微生物总量的影响

由图5可知，接种青枯菌前，除0.5 mmol/L DP处理外，其余处理的微生物总量均显著低于CK，1.0 mmol/L DP处理的根际微生物总量最少，为109.3×106 CFU/g。发病初期，各处理微生物总量均显著低于CK，0.5 mmol/L及1.0 mmol/L的DP和BHT处理的根际微生物总量较接种前明显下降，其中1.0 mmol/L DP处理最低，为74.34×106 CFU/g。发病高峰期，0.5和1.0 mmol/L DP处理的根际微生物总量较发病初期明显增加，0.2 mmol/L BHT处理的根际微生物总量明显下降，其余处理较发病初期无明显变化，且均显著低于CK。发病末期，除0.2 mmol/L DP处理较发病高峰期的根际微生物总量增加外，其余处理的根际微生物总量与发病高峰期无明显变化，微生物总量趋于平稳。以上结果表明，2种活性物质处理均可降低土壤微生物总量，且在发病初期高浓度处理后的土壤微生物总量显著下降。

2. 5 2种活性物质对根际细菌数量的影响

各处理的根际细菌变化趋势与根际微生物总量相似（图6）。接种青枯菌前，除0.2和0.5 mmol/L DP处理外，其余处理的根际细菌数量均显著低于CK，其中1.0 mmol/L DP处理的根际细菌数量最少，为78.93×106 CFU/g。发病初期，各处理的根际细菌数量显著低于CK，除0.2 mmol/L的DP和BHT处理外，其余处理的根际细菌数量较接种前明显下降，其中1.0 mmol/L DP处理的根际细菌数量最少，为54.4×106 CFU/g。发病高峰期，0.2 mmol/L的DP和BHT处理的根际细菌数量较发病初期明显下降，其余处理无明显变化，各处理均显著低于CK。发病末期，除0.2 mmol/L DP处理和0.5 mmol/L BHT处理的根际细菌数量较发病高峰期明显上升外，其余处理无明显变化。表明2种活性物质具有抑制根际细菌增殖的作用。

2. 6 2种活性物质对根际真菌数量的影响

各处理的根际真菌数量远少于细菌数量（图7）。接种青枯菌前，各处理的根际真菌数量均显著低于CK，其中DP处理的根际真菌数量少于BHT处理。发病初期，除0.5 mmol/L DP处理外，其余处理的根际真菌数量均显著少于CK，DP处理的根际真菌数量较接种前明显增加，0.5 mmol/L BHT处理的根际真菌数量较接种前明显下降。发病高峰期，0.2 mmol/L DP处理的根际真菌数量较发病初期明显增加，其余处理的根际真菌数量较发病初期明显下降，其中1.0 mmol/L BHT处理最低，为0.52×106 CFU/g。发病末期，0.2 mmol/L BHT处理的根际真菌数量较发病高峰期明显增加，0.2 mmol/L DP处理及0.5和1.0 mmol/L BHT处理的根际真菌数量较发病高峰期明显下降，其中0.5和1.0 mmol/L BHT处理的根际真菌数量显著低于同时期其他处理。表明2种活性物质处理均可降低根际真菌数量，其中BHT的抑制效果更强。

2. 7 2种活性物质对根际放线菌数量的影响

各处理的根际放线菌数量变化趋势与真菌数量变化趋势存在差异（图8）。接种青枯菌前，1.0 mmol/L BHT处理的根际放线菌数量显著低于其他处理，其余处理间根际放线菌数量差异不显著。发病初期，1.0 mmol/L BHT处理的根际放线菌数量较接种前明显增加，其余处理明显下降，所有处理均显著低于CK。发病高峰期，0.2 mmol/L BHT处理的根际放线菌数量降至14.93×106 CFU/g，明显低于发病初期，0.2和1.0 mmol/L DP处理的根际放线菌数量较发病初期明显增加，其余处理无明显变化。发病末期，不同处理根际放线菌数量较发病高峰期明显增加，除0.2 mmol/L BHT处理外，其余处理的根际放线菌数量均显著高于CK。

在人工接种青枯菌的条件下，DP和BHT 2种活性物质处理均可在发病初期显著抑制放线菌的增殖，且DP的抑制效果强于BHT。

3 讨论

根系分泌物是土壤中化感物质的重要来源，其组成及含量与植株种类和土传病害抗性息息相关（Luo et al.，2015）。据报道，邻苯二甲酸等具有一定抑菌活性的衍生物普遍存在于茄子的根系分泌物中（周宝利等，2011）。王维华等（2021）发现在抗线虫辣椒根系分泌物中含有邻苯二甲酸二丁酯，而在感病辣椒品种的根系分泌物中未发现。多种植物根系分泌物中的酚酸类物质也被证实存在抗病作用（周艳丽等，2011;齐永志等，2021）。乙醚是一种优良的萃取剂，相较于本课题组前期使用的乙酸乙酯和石油醚（赵文宗，2019），乙醚具有极性低、可萃取大部分的有机物质、沸点高及易浓缩等优点，采用乙醚进行萃取有助于发掘课题组前期未发现的活性物质。本研究在嫁接番茄根系分泌物的乙醚萃取组分中新鉴定出DP和BHT 2种之前在其他萃取剂组分未检测到的物质。DP是邻苯二甲酸的衍生物，BHT是酚酸类物质，通过验证，DP和BHT是嫁接番茄根系分泌物中提高番茄青枯病抗性的主要活性成分。

根系分泌物中的特异活性物质可通过直接影响病原菌的生长繁殖来影响植株的抗病性。研究发现，在青枯菌侵染条件下，添加有机酸和水杨酸后能显著降低番茄的发病率和植株茎内的青枯菌数量（范雪滢，2016）。施加BHT和棕榈酸后可显著降低感病番茄的根结线虫发病率和虫卵的孵化率，提高2龄幼虫的死亡率（Yang et al.，2016）。本研究中，DP和BHT灌根处理后的高感青枯病番茄在接种青枯菌后，发病率及病情指数均下降，效果最好的是2.0 mmol/L DP处理，但在研究中发现，2.0 mmol/L的DP和BHT灌根处理会使部分植株生长发育受到影响，严重的会发生叶片发黄脱落现象。段曦等（2017）在对辣椒的研究中也发现，高浓度的二苯并呋喃和邻苯二甲酸二异辛酯处理会使辣椒叶片发生失绿现象，并推测可能与高浓度的根系分泌物活性物质浇灌伤害了植株根系有关。因此，出于生产实践应用考虑，在本研究的后续试验中2种物质的最高浓度设为1.0 mmol/L。

本研究结果显示，DP和BHT 2种活性物质混合处理比单一物质处理的防病效果好，其中1.0 mmol/L相同浓度混合处理的发病率和病情指数分别降至46.7%和42.5。董月（2014）对番茄青枯病拮抗菌的研究中也发现，提高根系的碳源多样性能有效提高解淀粉芽孢杆菌T-5对青枯菌的抑制作用，单一碳源条件下，青枯菌平均抑制率仅为36.2%，而18种碳源复合条件下青枯菌抑制率达89.2%。

土壤微生物生物量是土壤环境变化的指示因子（马志良等， 2019），嫁接番茄对青枯病抗性的增强与根际土壤中细菌和放线菌数量的下降有关（赵文宗，2019）。根系分泌物可改变土壤微生物群落，据报道，小麦根系分泌物中的酚酸类物质可抑制细菌的活性（Wu et al.，2001）;番茄根系分泌物中的脂类物质可降低根际可培养放线菌数量（Yang et al.， 2016）;烟草根系分泌物中的酚酸类物质可降低根际可培养真菌数量（刘艳霞等，2019）。本研究结果显示，施加BHT和DP能降低番茄植株体内及根际的青枯菌数量，降低土壤微生物总量;1.0 mmol/L的2种活性物质处理均可显著抑制根际细菌生长，降低根际及植株体内青枯菌数量;高浓度的BHT可抑制根际真菌生长;所有浓度的DP均可在发病初期显著抑制根际放线菌的生长。说明2种根系分泌物质通过影响根际微生物提高番茄植株对青枯病的抗性。值得注意的是，土壤微生物稀释平板法作为对根际土壤微生物研究的基本方法，并不能完全反映土壤微生物的實际情况，且易受外界因素干扰，出现误差，仅能作为根际土壤微生物结构和数量的初步参考，下一步拟结合高通量测序技术进一步探讨根系分泌活性物质对根际微生物的影响。同时，植物根系分泌物的组分复杂，其中是否还存在更多能提高番茄对青枯病抗性的活性物质还有待进一步探究。

4 结论

采用GC-MS技术鉴定分析嫁接番茄的根系分泌物成分，筛选出邻苯二甲酸二甲酯和2，6-二叔丁基对甲苯酚2种活性物质，其可通过改善根际微环境、降低植株体内和根际的青枯菌数量而提高番茄对青枯病的抗性。

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（責任编辑 麻小燕）