邓陈琪，聂 尧，徐 岩

(江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

度洛西汀(Cymbalta，欣百达，化学名为(S)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩)-1-丙胺) 是一种5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取的双重抑制剂(SNRIs)[1]，适用于治疗重度抑郁症、强迫症及压力性尿失禁[2]。作为一种多功能手性药物，度洛西汀的功效明显优于市面上其他抗抑郁药的功效，具有不亲和于神经元受体和副作用少的优点[3]。Liu等[4]发现仅(S)-型对映体具有药物活性，因此合成光学纯(S)-度洛西汀具有重要的价值。

1990年，礼来公司利用(2R,3S)-(+)-4-二甲氨基-1,2-二苯基-3-甲基-2-丁醇与氢化铝锂两者2∶ 1的络合物催化N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP) 不对称还原反应，成功获得光学纯度约80%～88%的度洛西汀前体(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺((S)-DHTP)[5]，逆向合成策略表明，单一构型的(S)-DHTP是合成度洛西汀生产的优良前体。手性中间体(S)-DHTP与1-氟萘缩合，利用2,2,2-三氯乙基氯甲酸酯和Zn进行去甲基化反应可生成(S)-度洛西汀(图1)。

图1 (S)-DHTP合成度洛西汀途径Fig.1 Route of Duloxetine synthesized from (S)-DHTP

2006年，Fujima等[6]整理了礼来公司从获得(S)-DHTP到合成度洛西汀的“拆分-去消旋-循环”策略发现，相对于化学反应副产物多、反应步骤繁杂等问题，在温和条件下具有精细的区域选择性和立体选择性的生物催化[7]是目前最绿色的合成手性药物方法。2005年，Soni等[8]首次报道了用微生物催化合成(S)-DHTP，利用土壤中筛选出的热带假丝酵母CandidatropicalisPBR-2催化DKTP生成(S)-DHTP，在30 ℃、pH 7.0条件下催化 1 g/L DKTP，添加细胞250 g/L，经48 h反应，产物(S)-DHTP产率约84%～88%，对映体过量值(e.e.)≥99%。

自然筛选或者基因工程手段构建重组菌株来合成度洛西汀其他前体的研究也有报道。2011年，Tang等[9]筛选出黏红酵母RhodotorulaglutinisCY12催化30 g/LN,N-二甲基-3-氧杂-3-(2-噻吩)丙酰胺(MOTPA)反应48 h，获得(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺((S)-MHTPA)，e.e.>99.9%。2012年，Ou等[10]应用液核固定化Candidapseudotropicalis104催化12 g/L 3-氯-1-(2-噻吩基)丙酮(CTP)，反应10 d能够完全转化为(S)-3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇 ((S)-CTPO)。同时，Wada等[11]通过基因挖掘方法，将来源于Exiguobacteriumsp. F42的目的基因构建至重组大肠杆菌中，能够不对称转化3-氧杂-3-(2-噻吩)丙酸乙酯(KEES)生成(S)-3-羟基-3-(2-噻吩)丙酸乙酯((S)-HEES)。Ren等[12]构建了重组酮还原酶ChKRED15转化10 g/L KEES生成 (S)-HEES，e.e.>99.9%。2014年，Ou等[13]在膜反应器上连续反应48 h催化5 g/LN-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮，转化率达100%。目前所报道的生物催化合成度洛西汀前体催化底物浓度普遍处于较低水平且反应周期长，全细胞催化的转化反应普遍存在胞内功能酶的局限性[14]，这是因为全细胞膜结构阻碍底物同酶的结合[15]。

羰基还原酶需要以烟酰胺辅酶因子(NADH或NADPH)作为供氢体参与氧化还原反应，实现辅酶循环是羰基还原酶催化手性酮能应用于实际生产的前提。在辅酶循环再生的方法中，多酶耦联法效率较高，目前广泛应用葡萄糖脱氢酶(GDH)作为NAD(P)H循环再生的耦联酶[16]。将两个或两个以上单独编码的蛋白质连接成一段新基因获得多功能融合蛋白，其邻近效应[17]通常会减少中间扩散距离，从而增加中间体在扩散逃逸前成功参与反应的可能性，降低中间体损失量，并且两个酶活性位点的靠近产生通道效应[18]，促进中间体从一个酶更快传输到下一个酶。融合蛋白体系促进了用催化不对称还原的羰基还原酶和辅酶再生的葡萄糖脱氢酶的两个酶活性中心之间的辅因子转移，促使反应所需辅因子向活性中心聚集，提升生物催化效率[19]。Holsch等[20]利用来自Synechococcussp. PCC 7942的3-酮脂酰-还原酶(KR)催化还原反应，来自MycobacteriumvaccaeN10的甲酸脱氢酶(FDH)实现辅酶循环再生，构建出具有双功能的融合蛋白，全细胞催化五氟苯乙酮(PFAP)不对称还原生成对映值大于99.9%的(S)-1-(五氟苯)乙醇((S)-PFE)，且产物产率为99.97%。Sührer等[21]构建融合酶体系KR-MycFDH不对称还原乙酸苯甲酰乙酯(EBA)生成弗洛西汀前体(S)-乙基-3-羟基-3-苯丙酸酯((S)-HPPE)，融合酶催化的反应产率比游离酶催化的反应产率提高39%。孙太强等[22]利用高选择性羰基还原酶CR2催化10 g/L DKTP，产物(S)-DHTP产率达到68%。李斌等[23]利用CR2催化1 g/L DKTP，产物(S)-DHTP产率为92.1%，e.e.>99.9%。

本文中,笔者以DKTP为底物，以柔性连接肽构建的高选择性羰基还原酶CR2[22]和辅酶再生的葡萄糖脱氢酶GDH所得的融合酶CR2-GDH为生物催化剂，不对称合成手性药物度洛西汀直接有效的手性中间体(S)-DHTP，构建摇瓶水平上单批次重组酶体系并优化反应条件，进一步考察摇瓶水平的分批补料反应，以提高底物浓度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

表达融合酶CR2-GDH的重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET-cr2-linker-gdh由笔者所在实验室构建和保藏[24]。

DKTP，上海阿拉丁生化科技有限公司；DHTP和(S)-DHTP，百灵威科技有限公司；卡那霉素，生工生物工程(上海)有限公司；辅酶NADP+，上海索莱宝生物科技有限公司；色谱级正己烷、异丙醇、乙酸乙酯，阿达玛斯公司；其他分析纯试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10；固体培养基添加琼脂20 g/L。

乳糖自诱导培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，α-乳糖10 g/L，无水葡萄糖0.5 g/L，甘油5 g/L，KH2PO46.8 g/L，Na2HPO47.1 g/L，Na2SO40.71 g/L，MgSO42 mmol/L，NH4Cl 2.67 g/L；pH 7.5～8.0。

以上培养基经121 ℃灭菌20 min后使用。

1.2 设备与仪器

Ultimate U-3000型高效液相色谱仪(HPLC)，美国DIONEX公司；7890B型气相色谱仪(GC-FID)，美国Agilent公司；Mini-Bead-Beater-8型低温高压匀浆细胞破碎机，美国冷泉港公司；UV-3102PC型分光光度仪，美国UNIC公司；Avanti J-E型冷冻高速离心机，美国Beckman Coulter公司；T&J-EnzyR 500mL*3型酶催化平行反应器，上海迪必尔生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌体培养

将菌株E.coliBL21(DE3)/pET-cr2-linker-gdh划线到含卡那霉素(50 μg/mL)的LB固体平板培养基上，37 ℃倒置过夜培养，挑取单菌落至5 mL LB培养基含卡那霉素(50 μg/mL)的试管中培养6～8 h，以2%(体积分数)的接种量转接入含卡那霉素(50 μg/mL)的700 mL乳糖自诱导培养基中，37 ℃培养3 h后变温至17 ℃诱导蛋白表达，诱导时长为60 h。

1.3.2 CR2-GDH重组酶粗酶液制备

将发酵液于转速8 000 r/min、低温4 ℃离心15 min收集菌体，用0.9% NaCl水溶液洗涤3次，收集菌体，用三乙醇胺磷酸缓冲(0.1 mol/L，pH 8.0)重悬(1 g湿菌体加入5 mL缓冲)，经高压匀浆破碎至液体澄清，12 000 r/min、0 ℃离心40 min，取上清液用0.22 μm水系滤膜过滤，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其表达蛋白条带大小是否与目的蛋白一致，可得粗酶液。

1.3.3 酶活力测定

200 μL酶活测定体系。三乙醇胺磷酸缓冲(0.1 mol/L，pH 8.0)，5 mmol/L底物DKTP，0.5 mmol/L NADPH，30 ℃温浴 3 min，最后加入适量粗酶液混合均匀，检测波长340 nm，经细胞成像微孔板检测仪扫描吸光度的变化情况，每组实验设置3个平行组，取平均值。

酶活定义：1 U(酶活单位)定义为以DKTP为底物时，每分钟将1 μmol NADPH转化为NADP+的酶量。

蛋白质含量测定按照Bradford法[25-26]，以牛血清蛋白为标准蛋白制作标准曲线，样品浓度以标准曲线计算获得。

比酶活的计算见式(1)。

比酶活=酶活/m(蛋白)

(1)

1.3.4 CR2-GDH不对称还原DKTP反应

15 mL反应体系：20 g/L底物DKTP，40 g/L 无水葡萄糖，0.1 mmol/L NADP+，三乙醇胺磷酸缓冲(0.1 mol/L，pH 8.0)，7 U融合酶CR2-GDH粗酶液，在30 ℃、200 r/min条件下反应12 h。

1.3.5 CR2-GDH不对称转化DKTP单批次反应单因素条件优化

在确定反应过程最适pH(7.5～9.0)的基础上，进而优化反应温度(25～55 ℃)、底物和辅底物葡萄糖质量比(1∶ (0.5～4))、转速(50 ～300 r/min)，并探究底物 (10 ～40 g/L)对不对称转化DKTP反应的影响。

1.3.6 CR2-GDH不对称转化DKTP摇瓶体系分批补料转化反应

15 mL反应体系：初始底物5 g/L，无水葡萄糖10 g/L，0.1 mmol/L NADP+，三乙醇胺磷酸缓冲(0.1 mol/L，pH 8.4)，7 U融合酶CR2-GDH粗酶液，在45 ℃、150 r/min条件下反应。每隔2 h补加5 g/L底物和10 g/L无水葡萄糖，补加5次，底物累积至30 g/L。反应24 h，每隔2 h取样进行产物HPLC光学纯度测定、定量分析以及底物GC-FID定量分析。

1.3.7 CR2-GDH不对称转化DKTP反应器连续过程调控反应

100 mL反应体系：底物30 g/L，无水葡萄糖60 g/L，0.1 mmol/L NADP+，三乙醇胺磷酸缓冲(0.1 mol/L，pH 8.4)，47 U融合酶CR2-GDH粗酶液，在150 r/min、45 ℃条件下维持反应过程pH恒定在8.4左右，反应12 h，每隔2 h取样进行产物HPLC光学纯度检测及定量分析。

分批补料方式：初始底物5 g/L，无水葡萄糖10 g/L，每2 h补加5 g/L底物和10 g/L葡萄糖，补加7次，底物累积至40 g/L。反应48 h，每隔2 h取样进行产物HPLC光学纯度测定及定量分析和底物GC-FID定量分析。

1.3.8 底物DKTP定量分析

将底物DKTP标准品进行GC-FID(氢火焰离子化检测器)分析，确定底物的保留时间，并制作DKTP标准曲线来定量分析底物变化。将反应液12 000 r/min离心30 min，取上清液过0.22 μm水系滤膜过滤，进行气相色谱定量分析。

检测条件：色谱柱为Econo Cap-Wax (30 m×250 μm×0.25 μm)，进样口温度230 ℃，检测器温度220 ℃，载气N2流速45 mL/min，H2流速40 mL/min，空气流速450 mL/min，进样量0.5 μL，分流比5∶ 1。程序升温为90 ℃保持0.5 min，50 ℃/min升温到200 ℃，保持4 min。底物DKTP保留时间为2.77 min。

1.3.9 产物(S)-DHTP光学纯度和产率分析

将产物(R,S)-DHTP、(S)-DHTP标准品进行HPLC分析光学纯度，确定不同构型手性醇产物的保留时间，并制作(S)-DHTP标准曲线来定量分析产物产率。为保证反应辅酶再生系统的有效进行，同时保证反应体系有效传质，本研究采用粗酶催化不对称转化反应。取反应液加两倍体积乙酸乙酯涡旋振荡5 min，离心去除反应液残余固形物，取上层有机相用0.22 μm有机系滤膜过滤后，样品密封避光低温保存，用上述方法进行高效液相色谱检测，根据两种构型的产物出峰面积计算产物光学纯度，产物产率根据产物(S)-DHTP和底物DKTP对应标准曲线算出的摩尔浓度进行计算。

检测条件：色谱柱为Chiralcel OD-H柱(250 mm×4.6 mm)，流动相为V(正己烷)∶V(异丙醇)∶V(二乙胺)=98∶ 2∶ 0.2，流速为1 mL/min，检测波长为241 nm。(R)-DHTP的保留时间为11.593 min，(S)-DHTP保留时间为13.342 min。

2 结果与讨论

2.1 融合酶CR2-GDH不对称转化DKTP的单批次反应体系

使用羰基还原酶(CR2)同参与辅酶原位循环的葡萄糖脱氢酶(GDH)通过柔性连接肽得到融合酶CR2-GDH，由于2个酶的活性位点邻近，有利于反应所需辅酶的传递，且粗酶转化反应在保留细胞内原有酶系的基础上，可解除细胞壁膜对反应传质的限制，有利于酶促反应进行[27]。在摇瓶体系中进行单批次反应，优化融合酶CR2-GDH单批次不对称转化DKTP的反应体系，进一步提高底物耐受性，提高产物产率。

2.1.1 反应过程pH对融合酶CR2-GDH不对称转化DKTP的影响

李斌等[23]测定了羰基还原酶CR2在不同pH(6.0～9.0)环境中的最适pH及其酸碱耐受性，结果表明CR2在pH 8.4 (0.1 mol/L TEA)时CR2催化DKTP的活性最高，在pH 7.5～8.5范围内CR2可以保持90%以上活性。此外，陈星星[28]研究发现，在中性pH环境中葡萄糖脱氢酶(GDH)稳定性最强，而且pH 7.0时催化葡萄糖活性最高。

为解决因葡萄糖参与辅酶再生循环、融合酶CR2-GDH催化的反应产酸问题，每2 h调控pH，研究反应过程中最佳pH，结果如图2所示。由图2可知:转化反应在偏碱性(pH 8.1～9.0)条件下催化效率更佳，特别是pH为8.4时产物产率最高，产物(S)-DHTP光学纯度高于99.9%，且在此环境下可以稳定存在。因此，最终选择pH 8.4作为最佳反应pH。

图2 pH对CR2-GDH不对称合成(S)-DHTP的影响Fig.2 Effects of pH on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP

2.1.2 辅底物与底物比例对融合酶CR2-GDH不对称转化DKTP的影响

辅酶循环再生是生物不对称还原中的关键问题之一。理论上需提供至少同底物DKTP等量的辅助底物葡萄糖以驱动融合酶CR2-GDH生物合成反应进行，在反应体系中加入过量的葡萄糖，促进CR2-GDH不对称转化DKTP时的辅酶再生循环系统有效运转。因此，考察辅底物与底物比例对融合酶CR2-GDH不对称转化DKTP的影响，结果如图3所示。

图3 m(葡萄糖)/m(DKTP)对CR2-GDH不对称 合成(S)-DHTP的影响Fig.3 Effects of m(glucose)/m(DKTP) on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP

由图3可知：在反应体系中m(葡萄糖)/m(DKTP)<2.0时，产物产率随着葡萄糖浓度增加而升高；当m(葡萄糖)/m(DKTP)≥2.0时，葡萄糖浓度增加对产率影响逐渐减弱，产物产率达到80%以上，且光学纯度高于99.9%。

2.1.3 反应转速对融合酶CR2-GDH不对称转化DKTP的影响

反应旋转速度影响反应体系中底产物的扩散和分配，进而影响产物产率。因此，考察在不同转速(50～300 r/min)条件下对融合酶CR2-GDH对不对称转化反应的影响，结果见图4。

图4 转速对CR2-GDH不对称合成(S)-DHTP的影响Fig.4 Effects of rotation speed on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP

由图4可发现：转速低于150 r/min时，随着旋转速度的增加，产物产率明显增加，表明传质是限速因素；转速高于150 r/min时，随着反应进行可观察到反应液中有絮状固形物，严重影响反应体系的传质作用，不利于催化反应的进行。因此，确定最佳转速为150 r/min，光学纯度保持99.9%以上。

2.1.4 反应温度对融合酶CR2-GDH不对称转化DKTP的影响

反应温度对转化反应的速率和酶的活性有显著影响。在前期研究中，李斌等[23]测定了不同温度(20～80 ℃)下羰基还原酶CR2的相对酶活，温度低于45 ℃时，CR2可以保持80%以上的活性，温度继续上升导致酶活损失，高于55 ℃时CR2完全失活。陈星星[28]研究发现GDH在温度25～42 ℃范围内，酶活呈线性趋势下降，温度高于42 ℃时酶活力迅速下降。因此，考察不同反应温度(20～55 ℃)对不对称转化DKTP的影响，结果如图5所示。

图5 温度对CR2-GDH不对称合成(S)-DHTP的影响Fig.5 Effects of temperature on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP

由图5可知：反应温度从25 ℃上升至45 ℃，产物产率随之上升至97.71%；当温度高于45 ℃时，产率急剧下降，结合对融合酶CR2-GDH的温度稳定性探究，在50 ℃融合蛋白失去活性，分析得出在过高的温度下，部分酶失活严重，影响反应催化效率。因此，融合酶CR2-GDH不对称转化DKTP的最适反应温度确定为45 ℃。

2.2 底物用量对融合酶CR2-GDH不对称转化DKTP的影响

生物催化反应通常存在底物抑制的问题，为了实现更高底物浓度下的高效反应，首先考察在不同底物用量 (10～40 g/L)下的反应进程，以确定融合酶CR2-GDH的底物耐受性，结果如图6所示。

图6 底物浓度对CR2-GDH不对称合成 (S)-DHTP的影响Fig.6 Effects of substrate concentration on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP

由图6可知：反应速率随着时间延长明显减缓，反应前期4 h反应剧烈，12 h反应后产物无明显增加；当底物为10 g/L时，反应进行4 h，底物基本完全转化；当底物为20 g/L时，反应进行到8 h，产物积累量达到最高(15.54 g/L)；当底物用量大于20 g/L时，前期反应速率明显降低且产物积累量极少(底物为30 g/L时产物产率仅达到21.5%)，存在明显底物抑制现象，影响反应催化效率。

2.3 融合酶CR2-GDH不对称转化DKTP的摇瓶分批补料转化

当反应体系中底物浓度超过某一特定值时，生物催化的酶促反应普遍受到底物对酶的毒害和抑制作用[29]。通过底物分批补给，可以有效减缓高底物浓度对酶促反应的不利影响。考察融合酶CR2-GDH不对称转化DKTP的摇瓶分批补料转化的影响，结果见图7。

图7 CR2-GDH不对称合成(S)-DHTP的分批补料反应Fig.7 Fed-batch reaction process on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP

由图7可知：初始底物为5 g/L，每隔2 h 补加5 g/L 底物、10 g/L无水葡萄糖，最终底物累积至30 g/L，24 h后终止反应；在30 g/L底物条件下采取分批补料策略，最终产物产率可达到92.96%，产物最终达到27.65 g/L，时空产率为2.30 g/(L·h)；与相同底物浓度下的单批次反应(产物产率为20.9%，产物最终产量5.2 g/L)相比,产率提高了72.06%。

2.4 融合酶CR2-GDH不对称转化DKTP的反应器体系连续调控

酶催化过程中有很多因素会影响到转化结果，反应器能够实现精确连续的过程调控，有利于进一步提高转化效率，将反应体系放大至100 mL，考察单批次不对称转化反应的催化效率，结果见图8。

图8 反应器放大体系CR2-GDH不对称合成 (S)-DHTP分批补料反应进程Fig.8 Fed-batch reaction process on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP by reactor system

由图8可知：当底物为30 g/L时，产物产率达到82.42%，时空产率为3.41 g/(L·h)；底物为40 g/L时,最终产物产率仅60.61%，生成产物光学纯度(e.e.)均大于99.9%。

为了更进一步提高底物浓度下的产物产率，采取分批补料的方式，每隔2 h 补加5 g/L 底物、10 g/L 葡萄糖，最终底物累积至40 g/L，经48 h反应，产物积累至34.02 g/L,产物产率达到85.05%，时空产率为1.69 g/(L·h)，光学纯度≥99.9%。对比前期研究中孙太强等[22]实现了10 mL反应体系下催化10 g/L底物DKTP，产物产率为62%，时空产率为1.3 g/(L·h)，本研究实现了更高底物浓度和更大反应体系的不对称转化反应。

3 结论

利用具有高选择性的羰基还原酶(CR2)和葡萄糖脱氢酶(GDH)融合后的重组酶CR2-GDH作为生物催化剂，以潜手性化合物DKTP为底物，不对称合成抗抑郁药物度洛西汀重要前体(S)-DHTP。

1)单批次不对称转化确定反应pH为8.4、辅底物葡萄糖40 g/L、0.1 mmol/L NADP+，在45 ℃、150 r/min条件下反应12 h，催化底物20 g/L DKTP，产物产率可达到95.07%，光学纯度(e.e.)≥99.9%。

2)采取分批补料方式，反应12 h，在摇瓶体系中将底物提高至30 g/L，产物产率达到92.96%，最终产物累积至27.65 g/L。

3)利用反应器放大反应体系，结合精确连续过程控制和分批补料策略，实现底物为40 g/L的不对称连续转化反应，产率达到85.05%，产物积累至34.02 g/L。