周婵 姜林辉 卢碧燕 冼丽英 袁锦玉

1)南方医科大学附属东莞医院 东莞 523000 2)广东东莞职业技术学院 东莞 523000

结直肠癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。根据世界卫生组织下属的国际癌症研究机构(IARC)发布的全球癌症统计数据(GLOBOCAN 2020)，预计2020年全球新增结直肠癌患者约193万，死亡人数约93.5万[1]。早期结直肠癌患者的预后相对较好，但是对于中晚期患者，即使接受手术、放化疗、新型靶向及免疫治疗，5 a生存率仍仅为50%～60%。结直肠癌的发生和进展是一个复杂的病理过程，涉及多种信号通路的调节。微小RNA(microRNA)属于内源性非编码单链RNA，与人类多种疾病密切相关[2-3]。本研究拟检测microRNA-192在结直肠癌、腺瘤和增生型息肉中的表达情况，探讨其与结直肠癌的临床病理因素的相关性，利用脂质体转染技术上调microRNA-192的表达，观察肠癌细胞株增殖和迁移能力变化。

1 资料与方法

1.1一般资料收集我院2010-01—2014-12病理科存档的结直肠癌标本45例，腺瘤25例，增生性息肉25例。所有入组的结直肠癌病例临床资料完整，术前均未行放化疗、靶向或免疫治疗，并经组织病理学证实为浸润性腺癌。结直肠癌的分期参照美国癌症联合委员会和国际抗癌联盟共同制订的结直肠癌TNM分期系统(2010年第七版)。本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2方法荧光定量PCR检测microRNA-192的表达：常规切片苏木素-伊红染色，在显微镜下选取代表性区域，8 μm厚度切片5张。使用北京天根生物科技有限公司生产的石蜡包埋组织切片总RNA提取试剂盒(DP439)提取总RNA。根据miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书逆转录合成cDNA。PCR反应条件：95 ℃起始模板变性15 min，94 ℃变性20 s，60 ℃退火延伸34 s，共45个循环。通过熔解曲线对扩增产物进行分析并相对定量。CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况：将各组细胞以1×105/孔的浓度分别接种于96孔板，每组设5个复孔，在不同时间点加入CCK-8工作液(10 μL/孔)，置于37 ℃、5% CO2的培养箱避光继续培养2 h，使用Model 680酶标仪在波长450 nm处测定吸光度值。Transwell小室装置检测细胞迁移能力：化学合成microRNA-192模拟物及阴性对照，利用LipofectamineTM 3 000试剂进行转染。各组细胞在转染48 h后使用胰酶消化，并用无血清培养基重悬制成1×105/mL的细胞悬液，取200 μL加入上室，在下室中加入800 μL含10%胎牛血清的培养基，置于培养箱中继续培养36 h，去除上室细胞，用4%甲醛固定10 min，台盼蓝染色，显微镜下随机选取5个400倍视野计算迁移细胞数目。

2 结果

2.1microRNA-192在不同组织中的表达情况荧光定量PCR检测结果显示，microRNA-192在结直肠癌中的表达水平低于结直肠腺瘤和增生性息肉(P<0.05)。见图1。

图1 microRNA-192对肠癌细胞株LoVo增殖和迁移能力的影响

2.2microRNA-192表达与临床病理参数的相关性在45例结直肠癌患者中，microRNA-192的表达水平与是否发生淋巴结转移相关(P<0.05)；而与患者的年龄、性别、肿瘤分级等无明显相关性(P>0.05)。

2.3microRNA-192对肠癌细胞增殖和迁移的影响CCK-8试剂盒和Transwell小室装置分别检测细胞增殖活性和迁移能力，结果显示，microRNA-192对人肠癌细胞株LoVo的生长和迁移均具有抑制作用(P<0.05)。见图2、图3。

图2 microRNA-192对肠癌细胞株LoVo增殖活性的影响

图3 microRNA-192对肠癌细胞株LoVo迁移能力的影响

3 讨论

结直肠癌是临床上常见的消化系统恶性肿瘤。近年来，随着社会经济的飞速发展和人口老龄化日渐加剧，结直肠癌的发生率亦呈持续上升的态势。据国家癌症中心新近发布的癌症发病与死亡统计数据估算，2015年我国新发结直肠癌病例数达38.76万[4]。鉴于我国人口基数庞大，结直肠癌已逐渐成为重大的疾病负担。尽管已有相关研究揭示了包括APC、KRAS、BRAF等基因突变在结直肠癌的发生、发展中发挥重要的作用，但仅有基因突变理论仍不足以阐释结直肠癌多样的生物学行为。表观遗传学异常尤其是DNA甲基化以及微小RNA、环状RNA等非编码RNA调控修饰在肿瘤恶性演进等方面的研究，近年来受到越来越多的关注。

microRNA是在生物体内普遍存在的一类具有重要调控功能但不编码蛋白质的短序列RNA。大量研究已经证实，microRNA可动态调节细胞分化、增殖、凋亡、迁移，参与生长发育、免疫应答和肿瘤发生等多种病理生理过程[5-6]。microRNA-192编码基因定位于人类染色体11q13.1位点。microRNA-192在消化道、肾脏和胸腺等正常组织中具有较高水平的表达。microRNA-192的表达失调与肾癌、肺癌等多种恶性肿瘤的发生密切相关。Lokeshwar和Khella 等[7-8]研究发现，在肾细胞癌肿瘤组织中microRNA-192表达较正常组织显著下调，过表达microRNA-192可抑制肾癌细胞的侵袭和迁移能力。在本研究比较了microRNA-192在结直肠癌、腺瘤和增生性息肉中的表达差异，发现microRNA-192在结直肠癌中的表达水平低于结直肠腺瘤和增生性息肉；在结直肠癌患者中，microRNA-192的表达水平与患者是否发生淋巴结转移相关；而与患者的年龄、性别、肿瘤分级等参数无明显的相关性；体外细胞实验证实，microRNA-192抑制人肠癌细胞株LoVo的生长和迁移。

综上所述，microRNA-192在结直肠癌中呈低表达状态，且与肠癌细胞生长和迁移相关，有可能成为抗肿瘤治疗的潜在靶点。microRNA-192具体作用机制仍然有待深入研究。