田 帅，谭梦超，韦 维，杨 娟，刘慧勤，黄桂香，王国全

（1 植物科学国家级实验教学示范中心，广西大学农学院，南宁 530005）

（2 南宁师范大学地理与海洋研究院）

（3 广西壮族自治区林业科学研究院）

（4 广西大学轻工与食品工程学院）

柑橘类种质资源在我国分布广泛，总产量在我国众多水果中位居首位，深受人们喜爱。柑橘类果皮中富含黄酮类化合物、类胡萝卜素、精油、纤维素等多种有益成分，其中柑橘精油用途最广泛[1-5]。柑橘精油具有很好的保鲜、抗氧化、抑菌等特点，主要应用于天然香料、食品保鲜、化妆品等行业[6-12]。‘沃柑’是‘坦普尔’橘橙和‘丹西’红橘的杂交品种，因具有外观好、晚熟、丰产、品质优等特点，是广西近年发展速度最快的柑橘品种，但该品种果实受锈螨危害易发生黑皮果。

柑橘锈螨，即柑橘皱叶刺瘿螨［Phyllocoptruta oleivora（Ashmead）］，又称柑橘锈壁虱，是世界性柑橘害螨。柑橘锈螨体型微小、繁殖快，随风力、昆虫、器械等途径传播蔓延[13-14]。目前，关于柑橘锈螨的研究主要集中于形态特征[15-16]、生物学[17-20]、发生规律[21-22]、防治措施[23-27]等方面。柑橘锈螨主要为害柑橘的幼芽、枝叶、果实等各个部位[28-31]。在果实发育期，柑橘锈螨成螨、若螨将自身口器刺入柑橘果实中吸取汁液，柑橘果实油细胞受到损伤产生破裂，形成黑皮果[32-34]，也称为“油皮坨”“油皮柑”。目前，柑橘锈螨危害形成黑皮果仅限于果实品质方面的研究，测定了黑皮果的可溶性固形物、糖酸比、维生素C 含量等生理指标[35-36]。本试验以‘沃柑’正常果和锈螨为害果为试验材料，研究了柑橘锈螨对‘沃柑’果皮的微观结构和挥发油成分2 个方面的影响，以期为全面分析柑橘锈螨的危害机理提供新的研究思路和理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

‘沃柑’果实于2019 年10 月7 日采自广西大学标本园，分别采摘正常‘沃柑’果实和锈螨为害果实，用蒸馏水冲洗干净，迅速收集果皮放入液氮中运回实验室，置于-80 ℃超低温冰箱中保存。

1.2 仪器与药品

超低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司，DW-86L338J 型号）、冷冻干燥机（德国CHRIST公司，ALPHAL-4 LD PLUS 型号）、扫描电镜（荷兰PHENOM 公司，F16502 型号）、高精度恒温水槽（THCY-18Q）、手动进样手柄（SPME）、萃取头（50-30UM DVB-CVR on PDMS 萃取）、气相色谱-质谱联用仪（日本岛津公司，TQ8040 型号）。

1.3 样品前处理

1.3.1 电镜样品前处理

取超低温冰箱中的果皮（长5 mm、厚3 mm），迅速转移到低温冷冻干燥机干燥24 h，用双面导电胶将干燥后的果皮样品粘贴在样品台上，喷金处理后进行扫描电镜观察拍照。

1.3.2 挥发油成分样品前处理

先将果皮粉碎，迅速取0.5 g 样品装入样品瓶中，再将萃取头插入进样口于250 ℃老化2 min，老化好的萃取头插入样品瓶顶空部分，推出纤维头，80 ℃条件下恒温磁力搅拌吸附1 h，然后从样品瓶上拔出萃取头，插入设置好条件的GC-MS 进样口，250 ℃条件下解析2 min 开始采集数据。

1.4 色谱和质谱条件

色谱条件：色谱柱（DB-5MS，30.0 m×0.25 mm，0.25 μm），进样口温度250 ℃，不分流进样，色谱柱起始温度50 ℃，保持1 min，以2.5 ℃/min 的速率上升至180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速率上升至250 ℃，保持10 min。载气（氦气），流速1.0 mL/min。

质谱条件：接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，离子化方式SIM，电子能量70 eV，扫描质量范围45～600 m/z。

通过NIST14.lib 标准谱库检索确定成分种类，采用面积归一法计算各成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 扫描电镜结果分析

由图1、图2 可以看出，‘沃柑’正常果皮表面整体呈平滑状，局部具有柑橘类果皮特有的皱褶，气孔完整，视野内未观察到角质层损伤，结构保持完整；柑橘锈螨为害果皮角质层出现明显龟裂，裂缝无固定方向，结构完整性受到严重破坏。

图1 ‘沃柑’正常果皮电镜图

图2 锈螨为害‘沃柑’果皮电镜图

2.2 挥发性成分结果分析

由表1 可知，‘沃柑’正常果皮共检测出来75种成分，占总峰面积的81.60%，萜烯烃类、酯类、醇类为主要成分，含量较高的成分有柠檬烯（52.26%）、月桂烯（5.25%）、2-蒎烯（1.75%）、芳樟醇（1.33%）、棕榈酸甲酯（1.20%）等。锈螨为害果皮共检测出来79 种成分，占总峰面积的72.87%，萜烯烃类、酯类、醇类为主要成分，含量较高的成分有柠檬烯（44.17%）、月桂烯（5.16%）、2-蒎烯（1.82%）、α-衣兰油烯（1.21%）、棕榈酸甲酯（1.17%）等。

‘沃柑’正常果皮和锈螨为害果皮共有相同成分54 种，其中柠檬烯含量均最高，‘沃柑’正常果皮中含量为52.26%，锈螨为害果皮中含量为44.17%（表1），与前人测定的柑橘类品种基本一致[37-38]。月桂烯的含量仅次于柠檬烯，其具有香油和天竺葵的特有香味。芳樟醇是柑橘香气的主要成分之一，具有特殊的花香味[39-41]。酯类、醛类、酮类等都是柑橘果皮挥发油中重要的香味成分，使果实散发出特有的芳香味[42-43]。

‘沃柑’正常果皮特有的成分有21 种（表1），其中特有的青叶醛和共有的香茅醛是主要的脂肪类香气，具有特殊的香味，可用于高级香料和精油的调制[44]。‘沃柑’果实受锈螨危害后产生了25 种特有的成分，有研究证实[45]，角鲨烯可参与清除果实内部的自由基，并提高氧负荷，可以起到很好的保鲜作用。

表1 ‘沃柑’正常果皮和锈螨为害果皮挥发油GC-MS 分析结果

续表1

续表1

由表2 分析得出，‘沃柑’受柑橘锈螨危害后，果皮醇类、萜烯烃类、醛类、酮类、酚类的含量降低，酯类、烷烃类、酸类、醚类的含量上升。‘沃柑’正常果皮挥发油成分有8 类，分别为醇类（6.94%）、萜烯烃类（65.89%）、酯类（3.59%）、醛类（2.89%）、酮类（0.58%）、酚类（0.29%）、烷烃类（1.02%）、酸类（0.40%），分别包含了20、19、15、8、4、3、3、3 种成分。柑橘锈螨为害果皮挥发油成分有9 类，分别为醇类（3.59%）、萜烯烃类（59.86%）、酯类（4.04%）、醛类（2.61%）、酮类（0.33%）、酚类（0.03%）、烷烃类（1.58%）、酸类（0.76%）、醚类（0.07%），分别包含了18、21、18、8、2、1、7、3、1 种成分。

表2 ‘沃柑’正常果皮和锈螨为害果皮挥发油成分的种类及相对含量

3 讨论与结论

柑橘锈螨为害果实诱发黑皮果，导致果型变小、果囊硬实、色泽和可口性变差，严重降低了果实品质。本研究重点讨论了锈螨为害后‘沃柑’果皮的微观结构和挥发油成分变化，证实了柑橘锈螨为害果实会引发果皮角质层结构破坏。果皮最外侧覆盖着一层疏水性脂质结构——角质层，是一种复合的、异质分布的生物聚合物，主要参与蒸腾作用、气体交换、亲酯物质运输等生理生化反应的调控，同时具有保持果实表面洁净、防止微生物和昆虫侵染等多种功能[46-56]。外源物的刺激会引起柑橘果皮角质层的成分和结构发生改变，而角质层结构和成分的异常改变与果实正常膨大发育之间的不协调，最终会引起果皮呈现大面积褐斑和果实内部生理紊乱，进而影响果实品质[57-60]。结合之前相关学者对柑橘角质层的研究结论对比分析得出，柑橘锈螨为害‘沃柑’果实会引起果皮角质层出现大面积龟裂，破坏果皮角质层正常结构，影响果实内部膨大发育和正常生理反应，从一定程度上可以解释柑橘黑皮果果型较小、色泽度和口感差的形成机理。

柑橘表皮角质层主要由脂肪族化合物和萜类化合物等组分构成，脂肪族化合物主要为C23～C33醛、C20～C31初级醇、C16～C34偶数碳原子链饱和脂肪酸、C18∶1、C18∶2不饱和脂肪酸和C21～C33奇数碳原子链烷烃，其中C24、C26、C28是主要的醛类物质，C29和C31在烷烃中占据着主要地位，部分柑橘角质层还检测到次级代谢物——微量胆固醇和酮类物质[58,61-62]。研究表明，环境改变和外源刺激会导致角质层组分发生改变，影响化合物的合成途径[63-64]。由此分析本试验中柑橘锈螨为害‘沃柑’果实引起醇类、萜烯烃类等物质含量的下降和酯类、烷烃类等物质含量的上升，根本原因是角质层中相应的生化反应途径受到柑橘锈螨危害刺激后发生了改变，引发了不同组分之间的相互转变。柑橘角质层的研究在生物合成、成分变化、形态结构等方面虽取得一定进展，但是存在成分研究具有偏好性，研究方向集中在含量和组分、种类方面，深层机理和多种功能相关性验证研究较少[65-67]。鉴于目前技术水平和相关机理研究的缺乏，试验数据尚不能很好地揭示挥发油成分种类及含量变化的生化反应途径机理。

柑橘锈螨危害形成黑皮果机理研究方面，明确相关侵染机制、角质层防御机制、果实内部的生理生化防御机制、分子水平的防御机制和反应通路显得尤其重要。由于柑橘种质资源众多，不同品种对柑橘锈螨的抗性不同，未来可以根据分子水平上的防御机制选育对柑橘锈螨具有特定抗性基因的优良品种，最终从根源上降低柑橘锈螨危害，提高柑橘果实品质。鉴于柑橘众多品种之间亲缘关系复杂，柑橘锈螨对不同柑橘品种的侵染机制，以及不同品种对柑橘锈螨的抗性机制是否会存在较大差异，仍有待于进一步的研究。