赵艳娜，邱 荣，沈 南，唐元家

1.上海交通大学医学院附属仁济医院风湿病科，上海市风湿病学研究所，上海200127；2.中国科学院上海营养与健康研究所，上海200031

成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相关蛋白（CRISPR-associated protein，Cas）组成的CRISPR/Cas 系统最早是在古细菌进化过程中形成的RNA 介导的适应性免疫防御机制，能够抵御病毒及外源DNA 的入侵［1］。CRISPR/Cas 系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型［2-3］，Ⅰ型和Ⅲ型系统识别和切割核酸序列需要大型的多Cas蛋白复合物［4］，而Ⅱ型系统只需要Cas9 核酸酶和单链导向RNA（single guide RNA，sgRNA）即可。在该系统中，Cas9核酸酶在sgRNA 的指导下对靶基因组DNA 进行切割并引起DNA双链断裂［5-6］。细胞通过非同源末端修复或同源重组修复双链断裂，修复过程中会引起DNA 片段的插入、缺失或替换，从而造成移码框突变，达到基因敲除的目的［7］。

目前，该技术已广泛应用到动物模型建立、哺乳动物发育研究中［8］。特别是近些年Cas9 转基因小鼠的出现解决了Cas9 递送的问题，极大地拓展了CRISPR/Cas9 系统在免疫学研究中的应用［9-10］。但是，大多数CRISPR/Cas9 系统中Cas9 和sgRNA 通常持续表达［11］。这往往会引起基因组DNA 过度切割，从而增加脱靶效应风险［12-13］。此外，一些关键基因敲除可能会导致细胞发育缺陷甚至胚胎致死。因此，为了研究这些基因的功能，往往需要构建条件敲除小鼠或者诱导型基因敲除小鼠，实现特定发育阶段或者特定时间点基因敲除。现在逐渐发展起来的可诱导性基因敲除技术通过诱导性表达Cas9或者sgRNA 来实现基因诱导型敲除，似乎能够有效克服上述局限性［14-15］。

四环素（tetracycline，Tet）诱导型表达系统由于具有高效性、精确性、可控性等优点，广泛应用于基因功能研究，例如基因过表达、基因干扰等［16-17］。……