贺德春，胡嘉梧，梁紫薇，李艳，邹梦遥，吴锦豪

1. 生态环境部华南环境科学研究所，广东 广州 510530；2. 仲恺农业工程学院，广东 广州 510225；3. 重庆三峡学院，重庆 404199

雌激素是一类由生物体内分泌系统产生或人工合成的具有较强内分泌干扰性的化合物，主要包括雌酮（E1）、雌二醇（E2）、雌三醇（E3）等天然雌激素和炔雌醇（EE2）、己烯雌酚（DES）等人工合成的雌激素。研究表明雌激素污染对动植物和人类均能产生一定影响，能扰乱水中鱼类的生理功能，影响其生殖与发育，影响植物根和芽的发育和开花，诱发人类乳腺癌和前列腺癌等，是一类备受学术界关注的有机污染物（Adeel et al.，2017；Zhao et al.，2019）。粪便是环境雌激素的重要来源之一，据Lange et al.（2002）的估算，欧盟和美国农场畜禽粪便雌激素的年排放总量分别为33 t和49 t，其中奶牛粪便雌激素排放占比分别为 63.6%和87.76%；中国猪粪、牛粪和人粪的雌激素年排放量估计值分别为16.7、9.55和2.03 （tLiu et al.，2012）；另有报道采用模型估算中国人和动物的类固醇雌激素总排放量为3069 t·a-1，其中三分之二来源于动物（Zhang et al.，2014a）。通常畜禽粪便会作为有机肥被还田使用，粪污还田过程中雌激素的流失会对农田土壤和周边地下水造成污染（Zhao et al.，2019）。因此，建立高效、准确、重现性好的粪便中雌激素分析方法，对研究畜禽粪便雌激素的含量及组成特征、堆肥等处理过程中降解转化规律、还田后环境影响及控制对策有重要意义。

相比其他基质，畜禽粪便样品基质较复杂，含有较多的干扰物质，仪器定量时易产生基质效应（Marchi et al.，2010）。因此，样品前处理，尤其是净化方法是分析过程的关键环节。常见的净化方法有自制硅胶柱净化（Liu et al.，2012）和固相萃取净化（付银杰等，2013；Gineys et al.，2010）。自制硅胶柱净化易因填料和填充过程的差异而不稳定，难以普遍采用。与自制硅胶柱相比，固相萃取小柱具有更宽的pH范围、更高的吸附容量和更好的重现性等。仪器方法主要有液相色谱法（付银杰等，2013）、气相色谱-质谱联用法（王建华等，2007；Derrien et al.，2011）和液相色谱-质谱联用法（Matĕjĺček et al.，2007；张洪昌等，2016）等。液相色谱法操作简便，但灵敏度低，结果重复性较差；气相色谱-质谱联用法虽灵敏、准确，但不能直接分析，需衍生化，操作繁琐；高效液相色谱-串联质谱联用法则是一种具有分析时间短、无需衍生化反应、可实现雌激素高灵敏度和快速准确分析的方法（余薇薇等，2020；Liu et al.，2014；Arioli et al.，2008）。

目前，国内外有关雌激素检测的方法大多是针对水体、活性污泥和土壤等基质，而专门针对畜禽粪便中雌激素测定的方法报道较少。现有报道中，付银杰等（2013）优化了畜禽粪便中17β-E2、E3和EE2测定的超声提取-固相萃取-高效液相色谱法，加标回收率为 75.1%—89.6%（RSD为 0.6%—5.7%）；韩进等（2019）采用超声提取-固相萃取-高效液相色谱法对堆肥粪便中17β-E2、E3和EE2分析的加标回收率为75.1%—117.0%（RSD为1.5%—5.7%）。在固相萃取-气相色谱-质谱法应用方面，刘敏等（2011）优化了猪粪中E1、17α-E2、17β-E2和E3的测定方法，加标回收率在 92.3%—137.4%；Singh et al.（2013）对猪粪中游离态雌激素分析的加标回收率为 (91%±13%)；Andaluri et al.（2012）对堆肥粪便中17α-E2、17β-E2、E1和E3等7种雌激素进行分析，加标回收率在 11%—185%（RSD＜8.4%）。此外，胡双庆等（2020）等采用微波辅助萃取-高效液相-串联质谱法分析猪粪中的E1、E2、E3、EE2和DES，加标回收率为61.3%—91.2%（RSD＜7.1%）。针对畜禽粪便基质复杂、干扰严重等问题，本研究引入同位素内标进行基质效应校正，同时进一步优化前处理方法，最终建立了一种高灵敏度且定量准确的畜禽粪便中雌激素测定的同位素内标-高效液相色谱-串联质谱方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与实验材料

UltiMate 3000高效液相色谱仪（美国Thermo公司）；TSQ Vantage三重四级杆质谱仪（美国Thermo公司）；Thermo Accucore Biphenyl（TAB）液相色谱柱（100×2.1 mm，2.6 μm，美国Thermo公司）；固相萃取装置（Mediwax-12，上海旌派公司）；冷冻干燥机（SCIENTZ-18N，新芝生物公司）；数控超声波清洗机（KQ-250E，昆山超声仪器公司）；离心机（TDL-5-A，上海安亭公司）；旋转蒸发仪（BÜCHI Rotavapor® R-300，瑞士步琦公司）；氮吹仪（NDK 100-2，上海百典公司）；CNW Poly-Sery HLB Pro固相萃取柱（500 mg，6 mL）；亲水性PVDF针式滤膜（25 mm×0.45 μm）和有机相尼龙针式滤膜（13 mm×0.22 μm），均购自上海安谱公司。

6种目标物雌酮（E1）、17α-雌二醇（17α-E2）、17β-雌二醇（17β-E2）、雌三醇（E3）、17α-炔雌醇（17α-EE2）和己烯雌酚（DES），购自德国Dr. E公司；与目标物相对应的6种氘代同位素雌酮-d2（E1-d2）、雌二醇-d2（E2-d2）、雌二醇-d3（E2-d3）和雌三醇-d2（E3-d2），纯度均为＞99%，购于加拿大CDN公司；炔雌醇-d4（EE2-d4，99%）和己烯雌酚-d8（DES-d8，99%），购于加拿大TRC公司；甲醇、乙腈（HPLC级、LC-MS级，德国CNW公司）、氟化铵（LC-MS级，美国Fluka公司）；高纯氮气（99.999%，广州丹欧童公司）。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液及工作液的配制：分别准确称取 6种雌激素（E1，17α-E2，17β-E2，E3，17α-EE2，DES）标准品 (10.00±0.01) mg，用甲醇溶解后转移至5 mL棕色容量瓶中定容，得到浓度为 2.00×106ng·mL-1的单一标准储备液；然后用甲醇稀释上述单一标准储备液，配制成含各组分浓度为 2.00×104ng·mL-1的混合标准储备液，于-20 ℃条件下保存。使用时，用甲醇稀释混合标准储备液，配制成2000 ng·mL-1的混合标准工作液。同法配制6种同位素内标的单一、混合标准储备液和工作液。定量工作曲线配制时需同时混合6种雌激素和同位素内标，工作曲线目标物的浓度梯度为1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng·mL-1，同位素内标的浓度为 100 ng·mL-1。

1.3 样品采集和制备

在广东省选取生猪养殖场，奶牛养殖场和肉鸡养殖场各1家，采集单头牲畜某一天排泄的所有新鲜粪便，用密封袋装好后尽快运回实验室，冷冻干燥48 h后研磨过20目筛，避光冷藏保存。

1.4 样品前处理

准确称取粪便样品 (1.00±0.01) g于 35 mL具塞玻璃离心管中，加入50 μL浓度为2000 ng·mL-1的同位素混合内标工作液，混匀后于4 ℃下冷藏放置12 h以平衡。向离心管加入10 mL乙腈，超声提取15 min后，3500 rpm离心10 min，将上清液转移至梨形烧瓶中，继续重复上述操作2次。合并3次提取液，旋转蒸发至近干，加1 mL甲醇复溶，再加7 mL纯水稀释，超声混匀后转移至10 mL离心管中，5000 r·min-1离心5 min，取上清液过0.45 μm PVDF滤膜后待净化。

HLB柱先后用5 mL甲醇、10 mL水及5 mL甲醇—水溶液（1:7，V/V）活化。将提取液上柱，调节过柱流速不超过1 drop·s-1，过完柱后用10 mL乙腈水溶液（15%）淋洗固相萃取柱，待无液体流过萃取柱后，继续抽真空20 min。样品用10 mL甲醇洗脱，洗脱液氮吹至1 mL左右，用甲醇定容至1 mL，过0.22 μm有机相尼龙滤膜后待测。

1.5 色谱和质谱条件

液相条件：Thermo Accucore Biphenyl液相色谱柱（100×2.1 mm，2.6 μm，美国Thermo公司）柱温为室温，流动相A为2 mM氟化铵溶液，B为甲醇；流速为0.4 mL·min-1，进样量为3 μL。梯度淋洗程序为：0—3.5 min，B从 50%升至 80%；3.5—6.5 min，B从 80%升至 100%；6.5—9.0 min，B保持100%；9.0—9.5 min，B从100%降至50%；9.5—12 min，B保持50%。

质谱条件：选择反应监测（Selected Reaction Monitoring，SRM）扫描模式，电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）。使用负离子电离模式，喷雾电压2.5 kV。离子源温度350 ℃，鞘气20.7 kPa，辅助气5.18 kPa，离子传输毛细管温度350 ℃，碰撞气0.2 Pa。各目标化合物的质谱分析参数见表1。

表1 各化合物的质谱分析参数Table 1 Tandem mass spectrometric parameters for target compounds

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

2.1.1 色谱柱选择

本研究选取了 Agilent SB-C18（SB-C18）和Thermo Accucore Biphenyl（TAB）两种色谱柱进行分离效果的对比。当进样浓度均为 50 ng·mL-1时，在优化仪器参数的基础上，使用TAB色谱柱分离时，包括E3、17α-E2、17β-E2和17α-EE2在内的大部分目标物的特征离子峰峰形和分离效果均好于SB-C18色谱柱。同时，相应同位素内标的特征离子峰在TAB上的分离效果也明显优于在 SB-C18色谱柱上的分离效果。因此选用TAB色谱柱分离雌激素。

2.1.2 流动相选择

选用常见的反相色谱流动相乙腈和甲醇进行对比。在样品的浓度为50 ng·mL-1时，乙腈作为流动相能得到雌激素良好的分离峰形，然而当样品中雌激素浓度较低时（1 ng·mL-1），乙腈作为流动相会导致部分目标物无法出峰或峰形变差；以甲醇为流动相时，分离的6个化合物可正常出峰且峰形较好，响应值也更高，如图1所示。因此选择甲醇为流动相。

图1 流动相为乙腈（a）和甲醇（b）时E1、17α-E2、17β-E2、E3、17α-EE2和DES特征离子质量色谱图（浓度为1 ng·mL-1）Fig. 1 Characteristic ion mass chromatograms of estrone,17α-estradiol, 17β-estradiol, estriol, 17α-ethinyl estradiol, and diethylstilbestrol under mobile phase of (a) acetonitrile and (b) methanol (1 ng·mL-1)

2.2 固相萃取条件的选择

2.2.1 提取剂选择

根据Human metabolome database（The metabolomics innovation center，2020）的数据，待测雌激素的 LogKow值（辛醇/水分配系数）为 3.13—5.19之间，为弱极性或中极性化合物。根据相似相溶原理，它们较易溶于弱极性或中极性有机溶剂。已报道的常用提取溶剂有：甲醇水溶液（Matĕjĺček et al.，2007）、乙腈（谭芳等，2014）、丙酮（Han et al.，2011）、甲醇∶丙酮（1∶1）（张洪昌等，2016；Chen et al.，2012；Zhang et al.，2014b）、乙酸乙酯（Liu et al.，2011；韩进等，2019）等，另有研究（刘敏等，2011）表明甲醇:丙酮（1∶1）的效果优于甲醇∶丙酮（2∶1），因此本研究选择甲醇∶丙酮（1∶1）（MeOH∶ACT（1∶1））、乙腈（ACN）与乙酸乙酯（EAC）作为提取溶剂进行对比（溶剂提取后净化操作相同），结果如图2。3种提取剂对6种雌激素均有较好的提取效果，对于加标量为 100 ng·g-1粪便样品，甲醇∶丙酮（1∶1）、乙腈和乙酸乙酯提取后各雌激素的回收率范围分别在 87.39%—99.47%、87.61%—97.38%和81.30%—99.12%之间。相对而言，乙酸乙酯对17β-E2提取的回收率相对偏低。此外，从特征离子的质量色谱图可见，使用甲醇∶丙酮（1∶1）提取时个别目标物的定量峰附近有几个较小的杂峰干扰定量，而使用乙腈提取时定量峰附近的杂峰较少，有利于准确定量，因此最终选择乙腈作为提取溶剂。

图2 提取剂对固相萃取回收率的影响Fig. 2 Effect of extraction solvent on the recoveries of SPE

2.2.2 淋洗剂的选择

合适的淋洗剂能在保留目标物的同时去除吸附在固相萃取柱上的干扰组分。实验所用SPE萃取体系为反相萃取体系，淋洗剂多为有机溶剂水溶液，对比了甲醇水溶液和乙腈水溶液的淋洗效果，发现乙腈水溶液的淋洗效果更好。进一步确定淋洗剂的配比，为了避免目标物被淋洗出来，有机溶剂比例不宜过高，因此对比了15%和30%的乙腈水溶液（CAN-Water solution）对目标物回收率的影响。结果如图3所示，用15%的乙腈水溶液淋洗效果更好，多数目标物的回收率在82.64%—116.76%之间。30%乙腈水溶液作为淋洗剂时会导致部分待测目标物（如E3）的流失（回收率降低至74.81%），因此综合考虑干扰去除效果和回收率，确定选用15%乙腈水溶液为淋洗剂。

图3 淋洗剂乙腈体积分数对固相萃取回收率的影响Fig. 3 Effect of volume fraction of acetonitrile in elution on the recoveries of SPE

2.2.3 洗脱剂的选择

洗脱是影响净化效果的重要环节之一，需要确定合适的洗脱剂及洗脱体积。据文献报道，在类固醇雌激素分析中常用的洗脱溶剂主要有甲醇（谭丽超等，2011；袁哲军等，2017）、乙腈（师博颖等，2018；Zheng et al.，2011）。本研究比较了10 mL体积洗脱下甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）不同配比的 5 种洗脱剂，即甲醇、甲醇∶乙腈（1∶9、1∶1、9∶1）和乙腈的洗脱效果，结果如图4所示。用甲醇洗脱时，6种目标物的回收率在82.28%—102.22%之间；用乙腈洗脱时，目标物的回收率差异较大，且对DES回收率过低（43.72%）；甲醇-乙腈混合溶剂的洗脱效果也均未表现出优势。此外，实验过程发现，乙腈做流动相时对低浓度样品的分离有影响，会使峰形变差或使部分目标物无法出峰（见图1），如用甲醇—乙腈溶剂进行洗脱，则需将洗脱溶剂完全吹干后再用甲醇定容，耗时较长且操作繁琐。因此综合考虑选择甲醇作为洗脱剂。对不同用量（8、10、15 mL）洗脱剂的洗脱效果进行了对比研究，3种体积洗脱剂对目标物洗脱的回收率在80.54%—102.44%之间（图5），均表现出较好的洗脱效率。相对而言，洗脱剂体积为8 mL时回收率较差，10 mL洗脱体积对大部分化合物的洗脱效果要优于15 mL的洗脱体积。因此选用10 mL甲醇进行洗脱。

图4 洗脱剂对固相萃取回收率的影响Fig. 4 Effect of elution solvent on the recoveries of SPE

图5 洗脱剂体积对固相萃取回收率的影响Fig. 5 Effect of eluent volume on the recoveries of SPE

2.2.4 固相萃取小柱的选择

Waters Oasis HLB（简称 Waters HLB柱）和CNW Poly-Sery HLB Pro（简称CNW HLB柱）小柱填料均为亲水亲脂平衡且水可浸润的反相吸附剂，对酸性、中性及碱性化合物均具有较好的吸附性能，两种柱子在功能上差别并不大，但价格相差较大。本研究对比了两种萃取柱的净化效果。结果表明，两种萃取柱对目标化合物均有较好的净化效果（图6）。CNW HLB柱除了对17α-E2的回收率略低（73.32%）外，对其余5种目标物的回收率均在90.11%—99.65%之间；Waters HLB柱对6种目标物的回收率为85.37%—113.26%。CNW HLB柱对3种目标物的回收率优于Waters HLB柱，综合考虑样品预处理效果与检测成本，选用CNW HLB柱作为固相萃取柱。

图6 固相萃取小柱的回收率对比Fig. 6 Recoveries comparisons of SPE columns

2.3 线性范围、检出限和定量限

配制 1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng·mL-1系列浓度的混合标准溶液进样分析，以目标物峰面积与同位素内标峰面积的比值为纵坐标，溶液浓度为横坐标，绘制定量工作曲线。结果表明，在1—1000 ng·mL-1浓度范围内，各目标化合物定量工作曲线的相关系数R2均≥0.9990。研究过程发现，6种目标物中17β-E2能够准确定量的浓度需要达到5 ng·g-1左右，为所有目标物中最难准确定量的物质。因此本研究选择5 ng·g-1的基质加标样品，根据公式MDL=t(n-1,0.99)×S（t取值单侧置信度99%，S为7次测定的标准偏差）计算方法检出限（LODs）和方法定量限（LOQs）（中国环境科学研究院，2010），得出各化合物的方法检出限为0.25—0.95 ng·g-1，方法定量限（4倍检出限）为1.00—3.82 ng·g-1，计算得到的方法定量限与实际研究情况相符（最高5 ng·g-1左右）。6种雌激素标准曲线的线性方程、相关系数、检出限和定量限等见表2。与其他方法相比（表3），在5—1000 ng·g-1的范围内，本方法 6种雌激素的回收率均在90.2%—103.2%以内，方法更稳定，选择性更好，检出限也较其他方法低。可见，同位素内标的使用能有效校正基质效应，提高定量的准确性。

表2 6种雌激素定量工作曲线的线性方程、相关系数、检出限、定量限、加标回收率和精密度Table 2 Linear equations, correlation coefficients (R2), LODs, LOQs, spiked recoveries and precisions of 6 estrogens

表3 方法回收率及方法检出限比较Table 3 Comparisons of Recovery and LODs of different methods

2.4 回收率和精密度

取猪粪样品进行低（5、50 ng·g-1）、中（200 ng·g-1）高（1000 ng·g-1）4 个浓度水平的基质加标重复实验以验证方法的稳定性和重现性，每个浓度水平重复 5次。加标样品在-4 ℃条件下放置过夜后用优化方法测定各目标物的浓度，并计算回收率与相对标准偏差（表2）。由表2可知，4个浓度添加水平的平均回收率为 90.2%—103.2%，RSD为0.09%—9.08%，方法适用浓度范围广，稳定性和重现性好。

2.5 实际样品检测

应用优化方法对某养猪场、某养牛场和某养鸡场不同生长时期或孕育阶段的样品进行检测，共分析了6个猪粪样品（保育猪、育成育肥猪和能繁母猪各2个）、3个牛粪样品（犊牛、育成牛和泌乳牛各1个）和3个鸡粪（肉鸡）样品，结果如表4所示。粪便雌激素种类及含量与畜种及其生长时期或孕育阶段有关。E1在所有畜禽粪便中都能检出，为检出率最高、含量也最高的雌激素，与部分相关研究的结果一致（Han et al.，2011），且泌乳牛粪便中E1含量高于犊牛和育成牛。17α-EE2和DES的可定量检出率较低，表明人工合成雌激素的使用已得到有效控制。鸡粪中雌激素的含量远高于猪粪和牛粪中的含量。17α-E2和17β-E2在保育期和妊娠期猪粪中能检出，而在育成育肥期未能定量检出，说明 E2与生殖和发育过程相关。此次分析的畜禽粪便样品中雌激素含量范围为＜LOQ—778.32 ng·g-1，与相关研究报道的含量水平一致（Andaluri et al.，2012；Hanselman et al.，2003）。

表4 畜禽粪便样品中6种雌激素的含量Table 4 The contents of 6 estrogens in livestock manures

3 结论

本研究建立了同时测定畜禽粪便中 6种雌激素的同位素内标-液相色谱-串联质谱测定方法。同位素内标的应用有效校正了前处理过程中基质效应及目标物损失导致的结果偏差，提高了方法的准确性和对不同粪便基质的适应性。该方法灵敏度高，准确性和重复性好，能够满足各类畜禽粪便中不同浓度水平雌激素的分析要求，为研究粪便雌激素含量水平、污染现状及控制技术提供了有效检测手段。