王志昇，李梦婷，姬勇敢，杨 文，杨 丽，杨萌萌

近年来，杆状病毒作为基因传递载体吸引了众多研究者的关注。然而，由于其介导的外源基因无法整合到宿主染色体中，随着传代次数的增多，外源基因逐渐降解，导致无法长效表达目的蛋白，限制了其作为基因传递载体的广泛应用。研究表明，睡美人(sleeping beauty, SB)转座子系统，通过以经典的DNA“剪切-粘贴”模式，能够将外源基因整合到宿主基因组中特异性的位点中。基于以上分析，为了克服杆状病毒瞬时表达的缺陷，该研究拟构建SB转座子-杆状病毒嵌合载体系统，以绿色荧光蛋白基因EGFP作为靶基因，以此来评价SB转座系统介导的杆状病毒作为基因传递载体在哺乳动物体内外的表达效率。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株和细胞

pFastBac DUAL表达质粒购自美国Thermo公司；pT2/HB、pCMV(CAT)T7-SB100质粒购自美国Addgene公司；人胶质瘤U87细胞和昆虫Sf-9细胞购自中科院细胞库。Sf-9细胞在Grace昆虫培养基(包含10% FBS、3.3 g/L酵母提取物和水解乳蛋白)，27 ℃培养箱中培养；U87细胞在DMEM培养基(10% FBS、1%青链霉素)，37 ℃、5% CO潮湿培养箱中培养。

1.2 实验动物

SPF级BALB/c裸小鼠，4～6周龄，雄性，体质量18～22 g，购自宁夏医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(宁)2020-0001。动物饲养于温度(22±1)℃、湿度(50±5)%、12 h/12 h昼夜交替的SPF级屏障实验室中。

1.3 主要试剂

Taq 酶、限制核酸内切酶和T4连接酶购自美国Thermo公司；CloneExpressUltra One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物公司；质粒小提试剂盒与凝胶回收试剂盒购自北京天根公司；丁酸钠购自美国Sigma公司；MTT试剂盒购自江苏凯基生物；DMEM培养基、Grace培养基、FBS及脂质体购自美国Gibco公司；兔抗EGFP多克隆抗体、Cy3-山羊抗兔荧光二抗、DAPI染液、抗荧光淬灭封片剂和EDTA(pH8.0)抗原修复液购自武汉谷歌生物。……