彭小飞，张 涵，廖家李，麦孜悦，曾 健

（广西医科大学第一附属医院胃肠腺体外科，广西 南宁 530021）

乳腺癌（breast cancer）是全球女性癌症相关死亡的主要原因，血管生成在乳腺癌的发展过程中起着至关重要的作用[1]。多项研究表明[2，3]，血管生成因子（如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β 等）水平以及其形成的微血管密度是乳腺癌存活率的重要预测因素。研究表明，脂联素与血管生成有关的差异表达基因密切相关，其由244 个氨基酸组成的3 kDa 蛋白，由脂肪细胞产生和分泌，是脂肪组织中分泌最多的蛋白类激素[4]，其受体在正常和恶性乳腺组织中均有表达[5]，具有抗炎和抗动脉粥样硬化的特性，可以抑制细胞增殖，降低胰岛素抵抗，促进细胞凋亡[6-8]。本研究主要探讨脂联素在乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 乳腺癌血管生成相关因子的筛选 基于癌症基因组图谱（TCGA）中的乳腺癌数据，结合AmiGO2 衍生的血管生成基因集，筛选出与乳腺癌血管生成有关的因子脂联素。利用GEPIA2 数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/）对癌症基因组图谱数据库进行分析，确定脂联素在正常组织及癌组织表达差异，并对其进行生存曲线分析。

1.2 一般资料 收集2019 年11 月～2020 年8 月广西医科大学第一附属医院手术切除且病理检查确诊为乳腺癌的癌组织及癌旁组织80 例，所有病例术前均未行放、化疗等治疗。收集患者的临床资料数据，包括年龄、月经史、肿瘤直径、淋巴结转移、组织学分级、ER、PR、HER2、Ki-67、临床分期。本研究经广西医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准，患者或家属均签署知情同意书。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色 制作石蜡包埋的组织标本，切片（厚4～5 μm），免疫组织化学采用S-P 法，一抗为兔抗人VEGF 单克隆抗体（福建迈新生物工程公司），工作浓度1∶20，S-P 免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。光学显微镜下观察，胞质或胞膜中呈现棕黄色颗粒为阳性染色信号，每例切片随机观察10 个高倍视野。按肿瘤细胞着色强度和阳性细胞率分别评分，其中细胞着色强度：无着色为0 分、浅黄色为1 分、棕黄色为2 分、棕褐色为3 分；阳性细胞率：无阳性细胞为0 分、阳性细胞数＜10%为1 分、11%～50%为2 分、51%～75%为3 分、＞75%为4 分。上述两者积分相乘为最后结果：0～2 分为－、3～5 分为+、6～8 分为++、9～12 分为+++。

1.3.2 qRT-PCR 法检测 提取癌和癌旁组织中的总RNA，逆转录成cDNA。PCR 反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共循环40 次。用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件进行数据处理，计量资料以（）表示，两组均数间比较采用t检验，组间比较采用方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 数据库信息结果分析 利用GEPIA2 软件（http：//gepia.cancer-pku.cn/）对肿瘤基因组图谱项目数据库中乳腺癌组织标本和乳腺正常组织的mRNA 表达数据进行分析,结果显示脂联素在乳腺正常组织中高表达（logFC＞1，P＜0.05），脂联素表达高低对乳腺癌预后有影响，见图1。

2.2 脂联素在乳腺癌组织和正常组织中的表达 乳腺癌组织中脂联素阳性表达率为65.00%（52/80），低于癌旁组织中的阳性率91.25%（73/80），差异有统计学意义（χ2=7.864，P＜0.05）。

2.3 脂联素mRNA 在乳腺癌组织和正常组织中的表达水平 乳腺癌组织中脂联素mRNA 相对表达量为（0.683±0.317），高于癌旁组织中的（0.493±0.294），差异有统计学意义（t=3.105，P＜0.05）。

2.4 脂联素表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系不同年龄、月经史、ER、PR、HER2、Ki-67 表达间脂联素表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同肿瘤直径、淋巴结转移、组织学分级、临床分期间脂联素表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图1 脂联素在乳腺癌组织和正常组织中的表达

表1 脂联素表达与乳腺癌临床病理特征的关系（n）

3 讨论

血管生成因子可以促使内皮细胞向肿瘤细胞迁移，经过增殖，最终管道化并分支形成血管环，进而促进肿瘤细胞的血管生成，导致乳腺癌的侵袭和转移。血管生成因子水平与乳腺癌的分期、分级和临床预后密切相关，在乳腺癌的发生和发展中具有重要的作用[9,10]。除此之外，血管内皮生长因子（VEGF）作为最重要的血管生成因子，其过度表达与人类的多种肿瘤（乳腺癌、胃癌、结肠癌等）的发生密切相关[11,12]。有报道称[13]，脂联素可能通过促进乳腺癌细胞自噬小体的活性和降低隔离体1/GAP 相关的酪氨酸磷酸化蛋白p62 信号通路来抑制癌细胞的生长。此外，脂联素通过调节LKB1-AMPK-SK6 轴抑制乳腺癌细胞的转移，并刺激AMPK 磷酸化，导致mTOR 活性降低，表现为SK6 磷酸化降低，进而导致肿瘤抑制因子LKB1 表达增加[14]。因此，脂联素具有延缓肿瘤生长、血管生成和VEGF 的表达特性，通过直接调节与肿瘤生长相关的信号通路来降低恶性肿瘤的发展已成为脂联素新的研究热点[15]。

研究表明[16]，被诊断为乳腺癌的肥胖患者的预后往往更差，而且无论绝经状态如何，癌症进展和复发的风险都会增加。另外，已证实肥胖和2 型糖尿病患者与其循环中脂联素的水平呈负相关[17]。因此，研制重组脂联素或脂联素受体激动剂，提高血清脂联素水平及脂联素受体水平可能为乳腺癌的治疗提供新的思路。本研究基于癌症基因组图谱（TCGA）数据库和AmiGO2 衍生的血管生成基因集，筛选出与乳腺癌血管生成有关的因子脂联素，通过免疫组织化学染色和RT-PCR 测定发现，脂联素在乳腺癌和正常组织中存在表达差异，脂联素在乳腺正常组织中的表达含量高于乳腺癌组织（P＜0.05）。结合患者临床病理特征分析，结果发现不同年龄、月经史、ER、PR、HER2、Ki-67 表达间脂联素表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同肿瘤直径、淋巴结转移、组织学分级、临床分期间脂联素表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），进一步说明脂联素具有抑制乳腺癌发生和发展的作用。

综上所述，脂联素在乳腺组织中呈高表达，乳腺癌组织中呈低表达，其可作为乳腺癌新的生物标记物，预测乳腺癌的发生、发展及预后，并为乳腺癌的治疗提供参考。