王春林 田启东 胡鸾 向勇 艾健 赵志勇 董有康

摘要：目的 研究拔伸松动手法对兔膝关节骨性关节炎（KOA）模型兔关节液中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化脂质（LPO）、丙二醛（MDA）的影响，探讨拔伸松动法促进兔KOA软骨损伤修复的机制。方法 将80只健康成年家兔随机分为实验组、对照组、模型组、空白组，每组20只。除空白组外，其余各组采用Videman T法建立KOA模型。实验组采用拔伸松动手法干预;对照组塞来昔布胶囊经胃灌药干预;模型组和空白组，不做治疗干预。实验完成后，抽取实验兔膝关节液，黄嘌呤酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，硫代巴比妥酸法检测丙二醛（MDA）含量，ELISA法检测过氧化脂质（LPO）含量。结果 实验组关节液中SOD浓度高于对照组和模型组（P<0.05）;LPO浓度和MDA浓度均低于对照组和模型组（P<0.05）。结论 拔伸松动手法可以升高KOA模型兔关节液中SOD浓度，降低LPO和MDA浓度，增强机体清除氧自由基的能力，促进损伤软骨的修复。

关键词：拔伸松动手法;关节骨性关节炎;SOD;LPO;MDA

中图分类号：R684.3 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）03-0069-04

【Abstract】Objective： To study the effect of pulling-stretching-loosening manipulation on superoxide dismutase （SOD）， lipid peroxide （LPO） and malondialdehyde （MDA） in rabbit synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis （KOA） model and to explore the mechanism of pulling-stretching-loosening method to promote the repair of rabbit KOA cartilage damage. Methods： 80 healthy adult rabbits were randomly divided into experimental group， control group， model group， and blank group， 20 rabbits per group. Except for the blank group， the other groups were given Videman T method to establish KOA models. The experimental group was intervened by pulling-stretching-loosening manipulation， the control group was intervened by intragastric administration of Celecoxib capsules and the model group and the blank group were not treated with therapeutic intervention. After the experiment was completed， the experimental rabbit knee joint fluid was extracted. The xanthine enzyme method was used to determine the superoxide dismutase （SOD） activity， the thiobarbituric acid method was used to detect the content of malondialdehyde （MDA）， and the ELISA method was used to detect lipid peroxide （LPO） content. Results： The concentration of SOD in the joint fluid of the experimental group was higher than that of the control group and the model group （P<0.05）. The concentration of LPO and MDA of the experiment group were lower than that of the control group and the model group （P<0.05）. Conclusion： The pulling-stretching- loosening manipulation can increase the SOD concentration in the synovial fluid of KOA model rabbits， reduce the concentration of LPO and MDA， enhance the bodys ability to scavenge oxygen free radicals and promote the repair of damaged cartilage.

【Key words】Pulling-stretching-loosening manipulation; Joint osteoarthritis; SOD; LPO; MDA

膝關节骨性关节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是一种以膝关节软骨变性、损伤，软骨基质降解为早期病理特征的慢性骨关节疾病。一般认为KOA的发病与氧自由基代谢、炎症介质、细胞因子及自身免疫有关[1-3]。氧自由基代谢失衡是KOA病变的重要机制，其中超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，丙二醛（MDA）、过氧化脂质（LPO）含量增高，软骨细胞凋亡加速[3]。本研究在临床实践基础上，观察拔伸松动手法对兔KOA模型关节液中SOD、MDA、LPO含量的变化，探讨拔伸松动法对兔KOA损伤软骨修复的机制，为临床推广应用提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年家兔80只，普通级别，单重：1.8～2.5Kg，雌雄不限，重量分布均一，均由昆明医科大学实验动物学部提供。

1.2 试剂盒 兔超氧化物歧化酶ELISA检测试剂盒、过氧化脂质ELISA检测试剂盒、兔丙二醛ELISA检测试剂盒。

1.3 造模 随机分为4组，每组10 只：实验组、对照组、模型组、空白组。稳定饲养7 d后，采用Videman T 造模方法，管型石膏伸直位固定兔右后肢膝关节6 周，制作兔膝骨性关节炎模型。

1.4 实验 分别于造模完成后3 d开始，予各组相应的干预措施。

1.4.1 实验组 给予拔伸松动手法治疗干预：（1）按揉膝眼、血海、鹤顶、阳陵泉、阴陵泉、足三里、委中诸穴，30秒/穴。（2）屈伸患膝关节15次。（3）拔伸法施以患膝10秒后放松，然后在拔伸下分别以小鱼际固定于膝关节下缘之内侧和外侧，向对侧推按5次（外侧向内侧，内侧向外侧）。（4）五指提拿髌骨10次，顺时针和逆时针活动髌骨5次，再上下左右推动髌骨各10次。（5）屈伸患膝关节15次。（6）拔伸患膝10秒，在拔伸过程中作膝关节小幅度内旋和外旋运动。每日1次，每次10 min，连续治疗20次。

1.4.2 对照组 给予塞来昔布胶囊经胃灌药干预，给药量按动物与人体的每kg体重等效剂量折算系数表计算给药剂量，大白兔剂量（mg/kg）=折算系数（W=3.3）*兔体重*人剂量（mg/kg）/人体重。将胶囊药物粉末搅拌于温开水中，配制成含药量为8.8mg/mL混悬液，放入冰箱备用，每日1次，连续治疗20次。

1.4.3 模型组 造模后正常饲养，不予干预措施，正常饲养20 d后取标本。

1.4.4 空白组 不予造模，不予干预措施，正常饲养20 d后取标本。

1.5 取材检测 所有动物于实验结束后1 d取材。耳缘静脉注射空气20 mL栓塞处死。取关节液：从髌上囊部位注入关节腔，注入0.9%的生理盐水0.5 mL，反复屈伸活动膝关节后，抽出腔内灌洗液。做好标记后立即置于-20 ℃冰箱中保存备检。

1.6 检测指标 黄嘌呤酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，硫代巴比妥酸法检测丙二醛（MDA）含量，ELISA法检测过氧化脂质（LPO）含量，以此作为了解自由基的反应指标。

1.7 统计学方法 实验数据应用SPSS 22.0 软件进行统计学处理，各组数据以（x[TX-*3/8]±s）表示。组间差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA），显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 4组治疗后家兔关节液中SOD浓度 F值=72.059，实验组与对照组比较P=0.04<0.05显著性差异;实验组与模型组比较，P=0.000<0.05有显著性差异;实验组与空白组比较P=0.415>0.05无显著差异。见表1。

2.2 4组治疗后家兔关节液中LPD浓度 F值=36.099，实验组与对照组比较P=0.05<0.05显著性差异;实验组与模型组比较，P=0.000<0.05有显著性差异;实验组与空白组比较P=0.952>0.05无显著差异。见表2。

2.3 4组治疗后家兔关节液中MDA浓度 F值=129.99，实验组与对照组比较P=0.00<0.05显著性差异;实验组与模型组比较，P=0.000<0.05有显著性差异;实验组与空白组比较P=0.78>0.05无显著差异。见表3。

3 讨论

目前认为KOA的发病与氧自由基代谢、炎症介质、细胞因子及自身免疫有关，在力学和生物学因素共同作用下导致软骨细胞、细胞外基质及软骨下骨三者降解和合成正常偶联失衡，病理结果为滑膜炎症反应和关节软骨损伤。研究证实：KOA患者体内氧自由基含量增高，可能是在免疫反应核吞噬过程中产生和或关节内产生的细胞因子刺激软骨细胞和滑膜细胞超常产生大量自由基[5]，SOD是超氧阴离子的清除剂，MDA为脂质过氧化的产物，二者是检测机体氧自由基水平的常用配对指标。SOD活力的高低間接反映机体清除氧自由基的能力，MDA含量的高低可间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，二者可作为动态评价防治KOA效果的客观指标。LPO是体内细胞膜性结构中的多介不饱和脂肪酸受到氧自由基的作用生成的脂质过氧化，膜脂质的过氧化，使膜结构和细胞功能受损而引起多种疾病，其变化可反映组织代谢障碍，细胞结构与功能损害的指标。SOD、LPO、MDA等氧自由基代谢失衡是KOA发病的重要病理改变，SOD对细胞损伤具有保护作用，对氧自由基代谢保持平衡起着至关重要的作用。KOA患者体内氧自由基含量增高，通过对软骨基质生理功能的改变，促使软骨细胞退变、凋亡[3]。

推拿手法治疗膝关节骨性关节炎已在临床广泛应用，主要选用按、揉、推、拿、运动关节等手法为主。戴七一等[6]采用揉髌手法治疗实验性兔膝骨性关节炎，探究软骨组织及细胞超微结构的影响，发现揉髌手法可明显延缓兔膝关节软骨组织的退行性改变。何伟等[7]人采用随机对比研究松凝分筋手法治疗膝关节骨性关节炎的临床疗效，证明松凝分筋手法的特异性治疗作用，疗效确切且可靠。拔伸松动法包括膝关节屈伸法、拔伸下推按法、髌骨松动法、拔伸下微旋法，前期的临床观察证实，膝关节拔伸松动手法治疗KOA疗效确切[8]，动物实验研究证实拔伸松动手法可降低KOA兔膝关节液中白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平，改善膝骨性关节模型的关节活动度，修复退变的软骨组织[9-10]。

本实验研究结果显示，兔KOA模型关节液中MDA和LPO浓度升高，对比空白组均具有显著性差异（P<0.05），提示氧自由基浓度增高，抑制了软骨细胞的增殖和软骨基质蛋白多糖及胶原的合成，加速软骨基质的降解，导致关节软骨损伤。而关节液中SOD降低（P<0.05），提示氧自由基清除能力降低，受损细胞修复能力下降。研究结果表明，实验组通过拔伸松动手法治疗干预后，关节液中的SOD浓度上升，LPO、MDA含量降低，与对照组（灌服塞来昔布组）和模型组比较有显著性差异（P<0.05），说明拔伸松动法可促进氧自由基的清除，减少氧自由基对软骨细胞结构和功能的损害，有利于兔KOA损伤软骨的修复。拔伸松动法治疗KOA有效，其作用机制可能为升高SOD浓度，降低LPO、MDA含量，从而改善KOA氧自由基代谢水平，提高抗氧化能力，促进机体修复损伤的软骨。本研究为临床推广应用拔伸松动手法治疗KOA提供了客观依据。

参考文献：

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[6]戴七一，文宗振，阮萍，等.揉髕手法对兔膝关节软骨组织及细胞超微结构的影响[J].中华中医药学刊，2012，v. 3009：1938-2145.

[7]何伟，方苏亭，王胜利，等.松凝分筋手法治疗膝关节骨性关节炎临床研究[J].长春中医药大学学报，2012，v.2804：752.

[8]王春林，邵长丽，向勇，等.拔伸松动法治疗膝关节骨性关节炎的临床观察[J].按摩与康复医学，2011，5（2）：24-26.

[9]王春林，向勇，田启东，等.拔伸松动法治疗兔膝骨性关节炎的实验研究.云南中医中药杂志，2010，31（9）：23-25.

[10]王春林，向勇，田启东，等.“拔伸松动手法”对膝骨性关节炎兔白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的影响[J].环球中医药杂志，2014：7（2）85-88.

（收稿日期：2020-11-09）