张晓龙，孟帅，吴春暖，熊冬生，张洁

1 天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060；2 中国医学科学院北京协和医学院血液病医院

在肿瘤的免疫治疗中，激活的T 细胞对肿瘤细胞具有强大的杀伤能力。然而传统的单克隆抗体治疗不能有效募集T细胞至肿瘤微环境。可同时识别两个不同靶抗原的双特异性抗体（BsAbs）［1］有望克服这一问题。最具有代表性的BsAbs是用于治疗前B 细胞急性淋巴母细胞白血病的双特异性T 细胞衔接子（BiTE）blinatumomab［2-3］。但blinatumomab 半衰期短，给药时间长，患者用药不便，并增加治疗相关不良反应发生率［4］。为解决BiTE 在体内半衰期短的问题，有研究人员设计了一种串联四价双特异性抗体（TandAb）［5-6］。本课题组前期研究将抗CD3 单克隆抗体（HIT3a）和抗CD19 单克隆抗体（HIT19a）的可变区序列通过不同长度的柔性肽连接，设计了串联四价双特异性抗体Tandab（CD3/CD19），验证了其与CD3+细胞或CD19+细胞具有良好的结合活性［7］，且在体内外能有效介导T 细胞对CD19+肿瘤细胞的杀伤［8］。然而T 细胞在活化过程中往往需要第二信号的协同刺激，因此，本课题组在Tandab（CD3/CD19）的基础上引入4-1BBL 胞外结构域，设计了一种融合蛋白Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）。2018 年12 月—2020 年6 月，本研究观察了Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）介导的T 细胞对B 细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 人急性T 淋巴细胞白血病细胞Jurkat、人B 细胞淋巴瘤细胞Raji由本实验室保存，正常人外周血由天津市血液中心提供，以上细胞均用含10% FBS、2 mmol/L L- 谷氨酰胺的RPMI-1640 培养基于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。人胚肾293T 细胞购自ATCC 公司，用含10% FBS 及2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM 培养基于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。限制性内切酶NotⅠ、NheⅠ及BamHⅠ购自NEB（北京）公司。T4 DNA 连接酶、DNA Marker、DNA 上样缓冲液购自北京全式金生物技术有限公司。Taq DNA 聚合酶购自上海申能博彩生物公司。Lipofectamine2000 购自Invitrogen 公司。质粒小量提取试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。DNA 片段胶回收试剂盒购自大连宝生物TaKaRa 公司。超滤管购于美国Millipore 公司。HisTrap excel蛋白纯化柱购自美国GE 公司。人IL-2 ELISA 试剂盒购自北京欣博盛生物科技公司。His-Tag ELISA试剂盒购自南京金斯瑞生物科技有限公司。Cyto⁃Tox 96 非放射性细胞毒性检测试剂盒购自Promega公司。鼠源性抗His-tag 单克隆抗体、抗人4-1BB 抗体及Alexa Fluor 488 标记的鼠源性抗His-tag 单克隆抗体购自MBL 公司。FITC 标记抗CD69 单克隆抗体、抗CD25 单克隆抗体及同型对照购自美国BD 公司。抗人CD3 单克隆抗体（HIT3a）由中国医学科学院血液学研究所提供。

1.2 慢病毒表达载体pLentiR.SV40-Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）的构建 采用常规酶切、连接等分子克隆方法构建慢病毒表达载体pLentiR.SV40-Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）。NotⅠ分别单酶切pLentiR.SV40-Tandab（CD3/CD19）载体和T-（G4S）3-4-1BBL载体，将相应长度的片段回收，并在T4 DNA 连接酶作用下进行连接，随后通过菌液PCR 和双酶切（NheⅠ和BamHⅠ）对连接产物进行鉴定。同时构建pLentiR.SV40-4-1BBL作为对照载体。

1.3 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）的纯化 按照Li⁃pofectamine2000 操作说明分别将pLentiR.SV40-Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）、pLentiR.SV40-Tandab（CD3/CD19）及pLentiR.SV40-4-1BBL 转染至293T细胞，48 h 后收集培养上清备用。 根据HisTrap Excel（1 mL）亲和镍柱的操作说明，对携带His 标签的目的蛋白于AKTA Primer 纯化系统中进行纯化。将含目的蛋白样品过滤除菌后置于超滤管（Amicon Ultra 30K）中浓缩，分装后保存于－80 ℃冰箱备用。同时取少许浓缩液根据His Tag ELISA 试剂盒操作说明进行定量。随后对样品进行Western blotting 检测，步骤参照文献［8］。

1.4 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）与靶抗原的结合活性检测 取对数生长期的Raji 细胞及分别经HIT3a 抗体或抗人4-1BB 抗体封闭后的Jurkat 细胞，分别加入纯化后的Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）、Tandab（CD3/CD19）、4-1BBL 或等体积的PBS，于4 ℃条件下共同孵育1 h。离心弃上清后，冷PBS 洗涤细胞3 次。向细胞中加入Alexa Fluor 488 标记的抗His-tag 抗体（终浓度为0.5 µg/mL），于4 ℃条件下孵育30 min。冷PBS 洗涤细胞2 次后，将细胞重悬于500 µL 的PBS，流式细胞仪检测Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）与CD19+细胞（Raji 细胞）、CD3+细胞（Jurkat细胞）、4-1BB+细胞（Jurkat细胞）的结合活性。1.5 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）介导的T 细胞对Raji细胞的杀伤作用观察

1.5.1 细胞分组及处理 采用CytoTox 96 非放射性细胞毒性检测试剂盒（Promega，LDH释放法）检测T 细胞对CD19+B 细胞的杀伤能力［9］。将健康成人富含血小板的白膜经密度梯度离心获取外周血单个核细胞，按照试剂盒操作说明通过免疫磁珠分选CD3+T 细胞，并通过流式细胞术检测获得率。收集处于对数生长期的Raji 细胞，将其密度调整为2×106/mL，分别取50 µL（1×105个细胞）加入96 孔板中，然后按照一定效靶比（E∶T=20∶1）加入T 细胞，使每孔的总体积为100 µL。分别于每孔加入0.08、0.8、8 pmol/mL 的Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）、Tandab（CD3/CD19）、4-1BBL 各100 µL。同时设置效应细胞自发释放孔、靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、体积校正对照孔及培养基背景对照孔，所有实验孔和对照孔至少设置3 个复孔。混匀后，以250 g 离心4 min 以确保效应细胞和靶细胞充分接触。将离心板置于37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下孵育8 h。

1.5.2 T 细胞对Raji 细胞杀伤能力检测 在收集细胞培养液上清前45 min，向靶细胞最大释放孔及体积校正对照孔分别加入20 µL 的裂解液。孵育8 h 后，250 g 离心4 min。用排枪从每孔转移50 µL上清至一个新的96 孔平底板中，每孔加入配置好的底物液，室温避光孵育，30 min后每孔加入50 µL的终止液，1 h内于490 nm处测量OD值。细胞杀伤百分比=（OD实验孔-OD效应细胞自发释放孔-OD靶细胞自发释放孔）/（OD靶细胞最大释放孔-OD靶细胞自发释放孔）×100%。

1.5.3 细胞培养液上清中IL-2 检测 分组及操作参照“1.5.1”，融合蛋白作用浓度为8 pmol/mL，孵育24 h 后，分别收集细胞及培养液上清。采用ELI⁃SA法检测细胞培养液上清中的IL-2。

1.5.4 T 细胞活化标志物检测 收集融合蛋白作用浓度为8 pmol/mL 的各组细胞转移至流式管中，PBS 洗涤1 次。于每管中加入20 µL APC 标记的抗CD3 抗体，4 ℃孵育30 min。PBS 洗涤2 次后于每管中加入20 µL FITC 标记的抗CD25抗体或FITC 标记的抗CD69 抗体，4 ℃孵育30 min。PBS 洗涤2 次，用300 µL PBS 重悬细胞，采用流式细胞仪检测CD3+CD69+细胞、CD3+CD25+细胞的比例。

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism 8 或Excel软件。计量资料以表示。两组比较采用t检验。多组比较采用单因素方差分析（one-way ANO⁃VA）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pLentiR.SV40-Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）构建情况 抗CD3、抗CD19 的可变区序列和4-1BBL胞外区序列分别通过不同长度的G4S 柔性肽串联。将整个表达框克隆入慢病毒表达载体中，多肽链一经表达，由于分子间同源结构的相互作用和二硫键的形成，两条多肽链首尾结合，形成同源二聚体结构（图1），这种结构分别具有两个同时针对CD3、CD19、4-1BB 的结合位点。Western blotting 结果表明，非还原状态的表达产物Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）在160 kD 或79 kD 处有相应条带；还原后仅在79 kD处有条带，与实验设计相符（图2）。

图1 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）的分子模型

2.2 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）与CD19+、CD3+、4-1BB+细胞的结合率 融合蛋白Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）与CD19+、CD3+、4-1BB+细胞均具有较好的结合活性。见表1。

图2 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）Westernblotting检测结果

2.3 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）介导的T 细胞对Raji细胞的杀伤作用 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）组T 细胞对Raji 细胞杀伤百分比与Tandab（CD3/CD19）组差异无统计学意义，但均高于4-1BBL 组（P均＜0.01）。在效靶比一定时（E∶T=20∶1），随着融合蛋白Tandab浓度增高，T细胞对Raji细胞的杀伤百分比逐渐增高，作用呈剂量依赖性（P均＜0.01）。详见表2。Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）组、Tandab（CD3/CD19）组、4-1BBL 组、PBS 组中细胞培养液上清中的IL-2相对水平分别为4.58 ± 1.06、6.83 ± 0.89、2.36± 0.60、1.03 ± 0.30，前三组均高于PBS 组（P均＜0.05）。 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）组、Tandab（CD3/CD19）组CD3+CD69+细胞、CD3+CD25+细胞比例高于4-1BBL组、PBS组（P均＜0.01）。见表3。

表1 融合蛋白与CD19+、CD3+、4-1BB+细胞的结合率（%）

表1 融合蛋白与CD19+、CD3+、4-1BB+细胞的结合率（%）

注：与Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）组相比，*P＜0.05，#P＜0.01。

组别Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）组Tandab（CD3/CD19）组4-1BBL组结合率4-1BB+细胞46.63 ± 3.75－69.83 ± 3.17#CD3+细胞87.00 ± 3.99 96.90 ± 2.33*－CD19+细胞95.77 ± 2.10 98.97 ± 0.15－

表2 不同浓度融合蛋白介导的T细胞对Raji细胞的杀伤百分比比较（%）

表2 不同浓度融合蛋白介导的T细胞对Raji细胞的杀伤百分比比较（%）

注：与4-1BBL组相比，*P＜0.01；同组内不同作用浓度两两相比，#P＜0.05。

组别Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）组Tandab（CD3/CD19）组4-1BBL组细胞杀伤百分比8 pmol/mL 70.35 ± 3.50*#69.47 ± 4.10*#11.64 ± 1.52 0.08 pmol/mL 32.57 ± 2.64*#37.68 ± 6.70*#5.29 ± 2.33 0.8 pmol/mL 43.74 ± 2.13*#47.19 ± 4.15*#6.76 ± 1.63

表3 8 pmol/mL融合蛋白作用后各组CD3+CD69+细胞、CD3+CD25+细胞比例比较（%，）

表3 8 pmol/mL融合蛋白作用后各组CD3+CD69+细胞、CD3+CD25+细胞比例比较（%，）

注：与PBS组相比，*P＜0.01；与4-1BBL组相比，#P＜0.01。

组别Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）组Tandab（CD3/CD19）组4-1BBL组PBS组CD3+CD25+细胞比例16.37 ± 2.44*#20.55 ± 2.73*#7.23 ± 1.70 4.99 ± 1.10 CD3+CD69+细胞比例73.78 ± 3.31*#81.70 ± 3.72*#30.31 ± 3.18*6.98 ± 0.60

3 讨论

目前主要有两种策略来募集T 细胞杀伤肿瘤细胞。第一种是利用嵌合抗原受体（CAR）修饰的T 细胞，同时为了增强效应，还可在CAR 中引入共刺激分子如CD28、4-1BB 或OX40［9］。另一种募集T 细胞的途径是 通 过BsAbs［10］。BsAbs 的一端 可 以 与T 细胞活化结构域结合，另一端则可以与靶细胞上的肿瘤相关抗原结合。本课题组曾构建和表达与CD3抗原、CD19抗原分别具有两个结合位点的串联四价双特异性抗体Tandab（CD3/CD19），它可以募集T细胞从而有效杀伤CD19+B细胞淋巴瘤细胞［8］。

T 细胞的激活在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用。初始T 细胞活化的第一信号是T 细胞受体的激活，第二信号便是共刺激信号。其中CD28/B7 是研究较多的共刺激通路，近年来对4-1BB/4-1BBL共刺激通路的研究也逐渐增多。4-1BB 主要表达在激活的T 细胞表面［11］，与其配体4-1BBL 或激动性抗体结合后可减少抗原特异性CTL 凋亡、提高效应T 细胞的杀伤功能，且有助于向记忆细胞的分化和维持［12-13］。尽管免疫检查点抑制剂在多种实体瘤中已被证明能够显著提高客观缓解率和生存期，但仅10%～30% 的恶性肿瘤患者有治疗反应［14］，这可能与肿瘤浸润的淋巴细胞大部分因代谢能量不足而处于耗竭状态有关，PD-1 阻断疗法也无法恢复线粒体活性［15］。然而，共刺激分子4-1BB 在耗竭性T 细胞中常呈高表达［15-16］，激活4-1BB 后可通过p38-MAPK 通路增强线粒体活性，恢复肿瘤浸润T细胞的供能［15］。另一项研究也证实，在胶质瘤模型中联合使用4-1BB激动性抗体和抗PD-1抗体后可以明显延长小鼠的存活期［17］。因此，在肿瘤的免疫治疗中，靶向共刺激受体4-1BB也是一种有效策略。

本研究中，我们在Tandab（CD3/CD19）的基础上引入4-1BBL 胞外结构域，设计了一种融合蛋白Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）。Western blotting 检测结果显示，在非还原状态下Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）同时具有单体、二聚体、多聚体等多种形式的存在，推测是由于分子间相互作用形成了同源多聚体。FACS 结果显示，Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）与CD3 分子的结合力较Tandab（CD3/CD19）有所下降，且Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）与4-1BB 的结合力较4-1BBL组也有所降低，推测可能的原因是多肽链羧基端4-1BBL 胞外区的引入影响了部分多肽链同源聚合成Tandab（CD3/CD19/4-1BBL），另外空间位阻可能也影响与CD3分子和4-1BB 的结合。杀伤作用检测结果表明，Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）介导的T 细胞对Raji 细胞的杀伤效果与Tandab（CD3/CD19）相当。我们在后续研究中将进一步优化连接4-1BBL 胞外区结构与抗CD3 抗体重链可变区结构的柔性肽的长度，进而在体内模型中探讨引入4-1BBL 后是否能增强T 细胞对CD19+肿瘤细胞的杀伤作用。

综上所述，融合蛋白Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）具有同时与CD3、CD19 和4-1BB 分子结合的能力，并可有效介导T 细胞对Raji 细胞的杀伤作用。上述结果为后期在体内验证该融合蛋白对CD19+肿瘤细胞的抑制作用提供了实验基础。