王占娣, 张 啦, 丁百莲, 史云东, 王雅妮, 鲁广秋, 贾 琳*,

(1. 玉溪师范学院 化学生物与环境学院，云南 玉溪 653100；2. 辽宁金品生物科技有限公司，沈阳 110179)

小菜蛾Plutella xylostella L. 又名小青虫，鳞翅目菜蛾科昆虫，以幼虫取食植物叶肉、嫩茎、幼荚和籽粒为害，其寄主范围广，包括十字花科、茄科、百合科、甘蓝和姜科等植物40 余种，其中，十字花科植物是小菜蛾主要寄主[1]。在世界范围内只要有十字花科植物种植的地区都有小菜蛾发生，因此，小菜蛾被称为世界分布最为广泛、蔬菜上最难防治且具毁灭性的鳞翅目类农业害虫[2]。在中国，小菜蛾遍布所有省份，发生面积高达213.33 万公顷[3]。北方地区一般从5 月中旬一直持续到10 月下旬。在热带和亚热带地区周年发生，特别是在云南地区，由于其特殊的气候条件和蔬菜种植结构的调整，小菜蛾常年处于高峰期，且发生规律呈多样化[4]。目前，小菜蛾的防治技术主要包括化学防治、生物防治和生态调控，其中化学防治是防治小菜蛾的主要手段，但由于化学农药的大量使用，小菜蛾对90%以上的化学农药已产生较强的抗性[1]。生物防治主要是利用寄生蜂、天敌和微生物等控制小菜蛾数量[5]，虽然生物防治在小菜蛾种群数量控制具有较大的优势，但由于小菜蛾发生时期与以上生物发生时期存在时间差异，导致小菜蛾前期防治效果不明显。害虫生态调控是利用多作物和非作物生境的设计与布局[6]，通过改变昆虫食物网组成结构调控害虫种群。研究发现，小菜蛾对单一寄主植物释放的挥发性物质具有明确的行为反应，而在多寄主植物共存时，小菜蛾对不同寄主植物的行为反应差异不明显[7]。然而随着产业的规模化和种植结构的调整，单一作物大面积种植结构逐渐增加，不利于害虫生态调控，迫切需要寻找新型、高效、不易产生抗性、对环境友好的绿色防治技术和产品。

现代研究发现，植物中的次生代谢物质能够调控植食性昆虫的行为，干扰植食性昆虫对植物作出的取食和产卵的定向/识别行为[8-11]。如郭明程等[12]研究发现，爵床甲醇提取物能干扰小菜蛾产卵行为；Keesey 等[13]报道，猕猴桃提取物对果蝇具有产卵趋避作用。王志宇等[14]报道，机械损伤后的薄荷对小菜蛾具有较强的驱避活性。在小菜蛾寄主植物，特别是十字花科蔬菜中，普遍存在有引诱小菜蛾取食和产卵的活性物质，这些物质能有效控制害虫的发生及危害，可用于绿色防控产品的开发。但不同蔬菜品种所含的活性物质存在差异，如Reddy 等[15]报道，结球甘蓝中含有6 个碳原子数的醇类或酯类，如1-己醇、1-己烯-3-醇、己醛、(E)-2-己醛、醋酸己酯、乙酸顺-3-己烯酯 (绿叶气体) 和 (Z)-3-醋酸己烯酯。韩宝瑜等[16]报道，白菜中含有烯丙基异硫氰酸酯、碳原子数在6～24 的烯烃类、酯类、醇类和绿叶气体等。

小白菜Brassica campestrs L. ssp. Chinensis var. communis 为十字花科芸薹属小白菜亚种蔬菜，具有生长周期短、适应性强、产量高等特点。在中国各地均有种植，其中，在长江中下游地区小白菜的种植面积可达30%～40%，在云南地区终年种植，年产量可达上万吨[17]。目前，小白菜是小菜蛾的主要寄主之一，表明在小白菜的次生代谢物质中存在能够使小菜蛾准确寻找和定位的活性物质，但至今未见有关小白菜中调节小菜蛾成虫行为的活性物质的报道。因此，本研究采用不同极性溶剂提取小白菜中次生代谢物质，评价这些物质对小菜蛾雌虫行为的调节作用，并鉴定其化学结构，探讨小白菜次生代谢物质对小菜蛾行为的调节作用，寻找防治小菜蛾的先导化合物，旨在为小菜蛾的绿色防治奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料、试剂及药剂

石油醚 (60%～90%) 和乙酸乙酯 (纯度99.5%)，西陇科学股份有限公司；二氯甲烷 (纯度99.5%)，国际集团化学试剂有限公司；无水乙醇 (纯度99.7%) 重庆川东化工集团有限公司；二次蒸馏水。

1.2 主要仪器

YC-SXT-06 六联脂肪仪，上海郓曹电子有限公司；RE-52 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SQ8T 气相-质谱联用仪美国PerlinEler；QC-1B 大气采样仪，北京劳保所。

1.3 供试昆虫

小菜蛾Plutella xylostella L. 幼虫采集于云南省玉溪市江川区的芥蓝田，在幼虫时期区分出其性别后，将雌、雄虫分别置于不同的盒子内，于室内用芥蓝苗培养至孵化出小菜蛾成虫。室内环境条件：温度 (27 ± 1) ℃，相对湿度为60%～70%，光周期为L : D = 12 h : 12 h。

1.4 试验方法

1.4.1 提取液的制备 称取10 g 小白菜，利用六联脂肪提取器，依次加入100 mL 不同极性溶剂 (石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、无水乙醇和石油醚)进行提取，提取时间以提取器内溶液颜色变淡为止。收集提取液，用旋转蒸发仪浓缩至10 mL。将浓缩液稀释至最终质量浓度分别为0.5、0.25、0.125 g/mL，于4 ℃下保存，备用。

1.4.2 提取液中化学成分的鉴定 采用气相色谱-质谱联用仪 (GC-MS) 鉴定提取液中化学成分。检测条件如下。

GC：进样量1.0 μL；分流比20 : 1；进样温度250 ℃。程序升温：初始温度40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 升温至260 ℃，保持10 min。

MS：传输线温度250 ℃；离子源温度250 ℃；扫描线：Tic(全扫描)；柱子：Ei 比-5MS(30 mm ×0.25 mm × 0.25 mm)；离子源70 eV；扫描时间和GC 时间一致，扫描范围m/z 33～550。

1.4.3 行为评价 取两个直径为0.8 cm 的滤纸片，分别滴加100 μL 质量浓度为0.5、0.25 和0.125 g/mL 的小白菜提取液。以等量的溶剂作对照 (CK)。自然晾干。将滤纸片分别置于Y 型管的两个支管中，主管引入20 头未交配的小菜蛾雌虫，风速控制在3～5 cm/min，设4 次重复，30 min后记录各支管中小菜蛾的数量。按 (1) 式计算小菜蛾的反应率。

R：反应率；NTr：处理组虫量；NCK：对照组虫量。

1.4.4 田间诱捕雌虫试验 试验安排在玉溪师范学院试验田内，面积22 m2，种植蔬菜为甘蓝。将小白菜蒸馏水提取液和无水乙醇提取液均配制成质量浓度为0.5 g/mL，作为供试液。取200 μL 供试液滴加到橡胶芯中作为处理。分别以等量的蒸馏水和无水乙醇作为对照。将橡胶芯悬挂于自制的简易诱捕器中。按照随机分组的方式，将诱捕器放在甘蓝田的不同位置，诱捕器局距离地面的高度为20 cm，3 d 后记录诱捕器内小菜蛾雌虫的数量。每处理2 次重复。

1.5 数据处理

试验数据利用SAS 8.0 软件进行分析，采用x2分析处理组与CK 组之间的差异性 (α = 0.05)；采用非均衡资料ANOVA 统计相同溶剂不同浓度提取液对小菜蛾雌虫行为调节作用 (α = 0.05)。

2 结果与分析

2.1 小白菜提取液对小菜蛾雌虫行为的调节作用

2.1.1 小白菜不同极性提取液对小菜蛾雌虫行为的调节作用 分别以石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷为溶剂提取小白菜，用得到的提取液处理小菜蛾雌虫。结果发现，处理组成虫数量随着提取液浓度的增加而降低。当其质量浓度为0.5 g/mL时，小白菜的石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷提取液组成虫数量明显高于CK 组；当其质量浓度为0.25 g/mL 时，只有小白菜的二氯甲烷提取液组成虫数量明显高于CK 组 (图1A、1B、1C)。而采用无水乙醇和蒸馏水提取小白菜时，其提取物组的成虫数量随着测试浓度的增加而增加，当其质量浓度分别为0.25g/mL 和0.125 g/mL 时，无水乙醇和蒸馏水提取液组的成虫数量明显高于CK(图1D、1E)。结果表明，5 种不同溶剂提取物对小菜蛾雌虫行为均具有调节作用，其中低极性物质在高浓度时及高极性物质在低浓度时对雌虫具有引诱效果。

2.1.2 小白菜不同极性溶剂提取物调控小菜蛾雌虫行为的比较 当提取物质量浓度在0.25～0.50 g/mL范围内时，小白菜无水乙醇提取液处理组小菜蛾雌虫数量与蒸馏水提取液处理组的差异不显著。当质量浓度为0.125 g/mL 时，蒸馏水提取液组小菜蛾雌虫数量明显高于无水乙醇提取液处理组(图2)。表明蒸馏水提取液对小菜蛾的引诱效果优于无水乙醇提取液。

2.2 田间诱捕效果

使用简易诱捕器，以小白菜提取液为诱捕剂，田间诱捕3 d 后调查诱捕器内小菜蛾雌虫数量。结果(图3)显示，溶剂对照诱捕到的虫口数量明显低于小白菜蒸馏水提取液和无水乙醇提取液，其中，蒸馏水提取液诱捕到的雌虫数量最多，明显多于无水乙醇提取液。表明小白菜蒸馏水中含有引诱小菜蛾的潜在活性物质。

2.3 提取液活性成分的分析

小白菜不同极性溶剂提取液总离子流色谱图见图4。结合NIST2012、WILEY 谱图库和文献报道，确定小白菜提取液的化学成分。结果(表1)显示，小白菜不同溶剂提取液中的主要成分为酯类、烷烃类、酮类、醇类、酸类、醛类和酰胺类。其中，二氯甲烷提取液中的主要成分为烷烃

类，乙酸乙酯提取液中的主要成分为酯类和少量的酰胺类；无水乙醇提取液中成分为醇类和酸类，分别为 Z -2-(9-十八烷烯氧基) 乙醇、9,12,15-十八碳三烯酸、棕榈酸、3,7,11,15-四甲基-2-十六烯-1-醇和8,11,14-二十碳三烯酸。小白菜蒸馏水提取液中的主要成分为异戊胆酸乙酯和9,12,15-十八碳三烯醛，其中异戊胆酸乙酯含量最高 。

表1 小白菜不同极性溶剂提取液主要化学成分Table1 The main chemical components of extraction from pakchoi with different polar solvents

3 结论与讨论

绿色防治技术是现代农业害虫防治研究的热点，从植物次生代谢物质中筛选基于挥发物的化学生态调控技术是绿色防治技术研究的主要途径。一般采用有溶剂浸提法、水蒸气蒸馏法、顶空收集法和固相微萃取技术从植物中获得调控昆虫行为的次生代谢物质，这些物质主要为相对分子质量在100～200 之间的醇类、醛类、酮类、酸类、酚类、乙炔类、含氮化合物、有机酸、萜烯类和芳香类挥发性物质[15-17]。如采用顶空收集法[15]和顶空固相微萃取法[18]从白菜中鉴定的化合物有2,5-乙二醇、反-2-己烯-1-醇、芳樟醇、香叶醇、反-4-己烯-1-醇、异硫氰酸酯类物质和硫代葡萄糖苷等。本研究采用热回流浸提法，利用5 种不同极性溶剂提取小白菜，对不同溶剂提取液进行成分分析发现，小白菜中的化合物主要为酯类、烷烃类、酮类、醇类、酸类、醛类、酰胺类和少量的酸类，这与采用顶空收集法和顶空固相萃取法提取的化合物种类相同。对强极性溶剂 (无水乙醇和蒸馏水) 提取液中的化合物进行分析发现，这些化合物的碳原子数在16～18 之间，相对分子质量在256～312 之间，碳原子数和相对分子质量均高于采用顶空收集法和固相微萃取技术得到的化合物。出现这种差异的原因可能为顶空收集法和顶空固相萃取法提取的物质为植物释放低挥发性物质，而采用热回流浸提法得到的物质主要为挥发性成分。

文献报道，寄主植物中释放的次生代谢物质对昆虫取食、交配和产卵行为具有调节作用[19]。如Gerofotis 等[20]报道，橄榄果实和叶片释放的挥发性物质有利于橄榄果蝇的交配。甘蓝受机械损伤或虫害后释放的低挥发性物质对小菜蛾具有引诱效果[21]，番茄释放的挥发物能诱导美洲棉铃虫雌虫产卵[22]。本研究发现，小白菜5 种不同极性溶剂 (石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、无水乙醇和蒸馏水) 提取液对小菜蛾雌虫具有明显的引诱效果，其中，无水乙醇和蒸馏水提取液的引诱效果明显高于其他处理。对这两种提取液的成分进行分析，发现在两种提取液中含有具有相同母环结构的化合物，即9,12,15-十八碳三烯醛 (小白菜蒸馏水提取液) 和9,12,15-十八碳三烯酸 (小白菜无水乙醇提取液)。文献报道碳链长度为10～18 的醛是鳞翅目昆虫信息素的活性成分[23]，如9,12,15-十八碳三烯醛是美国白蛾性信息素的主要成分[24]。9,12,15-十八碳三烯酸又称为亚麻酸，是植物挥发性物质合成的前体物质[25]。棕榈酸乙酯对枣实蝇具有明显的引诱效果[26]，棕榈酸对薇甘菊颈盲蝽具有明显的引诱效果[27]，同时这两个化合物还是异迟眼蕈蚊性信息素主要成分[28]，但尚未见棕榈酸、棕榈酸乙酯和其他成分对鳞翅目昆虫具有行为调节作用的报道。小白菜蒸馏水提取液中含量最高的化合物为异戊胆酸乙酯，该化合物为甾醇类物质，具有挥发性[29]，但未见其对昆虫行为具有调节作用的报道。由此推测，9,12,15-十八碳三烯醛和9,12,15-十八碳三烯酸是小白菜蒸馏水提取液和无水乙醇提取液调节小菜蛾雌虫行为的活性物质，其中，前者的分子质量 (262 Da) 小于后者(分子质量为278 Da)，挥发性前者强于后者，这可能是小白菜水提液对小菜蛾雌虫的引诱活性高于小白菜乙醇提取液的原因之一。9,12,15-十八碳三烯醛和9,12,15-十八碳三烯酸是否是小菜蛾性信息素，其对小菜蛾雌虫行为调节方式是交配还是产卵引诱，以及异戊胆酸乙酯对小菜蛾是否具有行为调节活性等，还需进一步研究。

本文基于绿色防治技术，从小菜蛾寄主植物之一的小白菜中鉴定出对小菜蛾雌虫具有引诱效果的物质，首次在小白菜中发现了9,12,15-十八碳三烯醛具有引诱小菜蛾雌虫的潜在活性，可用于小菜蛾绿色防控产品的开发。