王永超，谢斌，王东凯

(1.沈阳药科大学药学院，沈阳 110016；2.珠海润都制药股份有限公司，珠海 519041)

单硝酸异山梨酯作用机制是释放一氧化氮，松弛血管平滑肌，降低心脏前后负荷，减少心肌耗氧量。临床上主要用于冠心病、心绞痛等心血管疾病[1-3]。本研究通过中国健康受试者空腹和餐后口服珠海润都制药股份有限公司生产的单硝酸异山梨酯缓释胶囊(受试制剂)与原研药品(商品名：Elantan®，参比制剂)，评价受试制剂与参比制剂生物等效性的可能性[4]。

1 试药与仪器

1.1试药 受试制剂：单硝酸异山梨酯缓释胶囊，规格：50 mg，批号：20180301，珠海润都制药股份有限公司生产；参比制剂：单硝酸异山梨酯缓释胶囊(商品名：Elantan®)，规格：50 mg，批号：9717503，Aesica Pharmaceuticals GmbH/Germany(持证商：UCB Pharma)生产。单硝酸异山梨酯对照品，含量：99.9%，批号：1029-206A1，由加拿大TLC公司提供；单硝酸异山梨酯-13C6(内标)，含量：99.8%，批号：1110-095A1，由加拿大TLC公司提供。

1.2仪器 Triple Quad 6500 plus质谱仪、Analyst 1.6.3分析软件均为AB Sciex公司产品；LC-20AD XR 高效液相色谱仪，Shimadzu公司；药动学分析采用Phoenix WinNonlin 软件(8.1版本)，描述性统计分析采用SAS 软件(9.4版本)。

2 方法与结果

2.1研究对象 本研究通过北京市房山区中医医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。空腹试验筛选198例，入组28例，完成试验28例，其中男17例，女11例，年龄为(34.8±8.36)岁，体质量为(61.3±8.72)kg，身高为(165.9±8.04)cm，体质量指数为(22.2±1.66)kg·(m2)-1；餐后试验筛选197例，入组28例，完成试验28例，其中男18例，女10例，年龄为(29.8±6.99)岁，体质量为(66.3±7.30)kg，身高为(168.4±6.98)cm，体质量指数为(23.3±1.58)kg·(m2)-1。

经询问无心血管(如心肌炎和冠心病)、肝、肾、内分泌、消化、代谢紊乱、青光眼等病史，无药物过敏史及滥用史，无烟酒嗜好，试验前2周未服用其他药物，实验室检查(血常规、血生化、尿常规、血清学)及心电图检查均正常或异常无临床意义，女性受试者妊娠检查正常，尿液药物滥用筛查、乙醇呼气检查、烟检均为阴性。受试者试验期间统一饮食，禁止剧烈活动等。

2.2给药方案与血样采集 本研究分别进行单次空腹和餐后用药，两制剂、两周期、两序列、随机、开放、两周期、自身交叉的平均生物等效性研究，清洗期为7 d。

受试者于每周期给药前一晚入住Ⅰ期临床试验病房，禁食10 h。空腹组于清晨空腹状态下，口服由研究人员发放的受试制剂或参比制剂50 mg，用温水240 mL送服。餐后组于8：00进食高脂高热餐，30 min内进食完毕。受试者在给开始用餐后30 min时，口服由研究人员发放的受试制剂或参比制剂50 mg，用温水240 mL送服。受试者用药前1 h至用药后1h禁止饮水，用药后保持上身直立状态2 h。用药后4和10 h进食午餐和晚餐。

空腹组每周期共需采集23管静脉血(每管3 mL)，分别在给药0 h(给药前60 min内)和给药后0.083，0.167，0.25，0.5，0.75，1，2，3，4，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，9，10，12，15，24和36 h，由前臂静脉采血3 mL。餐后组每周期共需采集23管静脉血(每管3 mL)，分别在给药0 h(给药前60 min内)和给药后0.5，1，2，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，12，15，24和36 h，由前臂静脉采血3 mL。7 d后交叉给药，相同时间点取血。

将血液采集至已标记好的含有EDTA-K2抗凝剂的真空采血管中。若使用静脉留置针采血，每次采血前弃去血液混合物约1 mL，每次采血后用适量肝素钠溶液进行封管。

生物样品采集后需转运至样本预处理室，于1.5 h内离心，1 700×g4 ℃离心10 min后分离血浆样本，抽取上层血浆分为两份转移至贴有标签的冻存管中，其中一份(≤1 mL)用于血样分析，另一份(≤1 mL)作为备份。离心后2 h内可将血浆样本置于-10～-30 ℃冰箱中暂存，并在24 h内转移至-60～-90 ℃超低温冰箱中保存，也可以直接置于-60～-90 ℃超低温冰箱保存。

2.3方法学考察与评价

2.3.1色谱条件 色谱柱：Ultimate XB C18(2.1 mm×50.0 mm，5.0 μm)；流动相A：含5 mmol·L-1乙酸铵溶液；流动相B：乙腈溶液；总流速：0.700 mL·min-1；梯度洗脱：0～0.1 min 10%B，>0.1～1.7 min 10%→90%B，>1.7～2.4 min 90%B，>2.4～2.5 min 90%→10%B，>2.5～3.2min 10%B；柱温：30 ℃；进样量：20.0 μL。

2.3.2质谱条件 离子源：ESI；离子化方式：负离子模式；扫描方式：MRM；MRM离子对：单硝酸异山梨酯250.1→59.1，单硝酸异山梨酯-13C6256.1→59.1。

2.3.3血浆样品处理 精密转移血浆样品80.0 μL至96孔板中，加入内标工作溶液(浓度为600 ng·mL-1)25.0 μL，加入乙酸乙酯800 μL，涡旋混合，在4 ℃ 1 700×g离心15 min；转移有机相500 μL至另一块96孔板中，由氮气吹干后加入乙腈：水(10：90)150 μL，涡旋混合5 min，取20.0 μL进样，进行LC-MS/MS分析，并记录色谱图。

2.3.4系统适用性 系统适用性评价样品为6个系统适用性定量下限样品，在每个分析批开始进样前均进行系统适用性评价测试，以确认该仪器状态。结果显示分析物保留时间的RSD≤0.9%，内标保留时间的RSD≤0.6%，分析物与内标峰面积比的RSD≤12.7%，表明系统适用性良好。

2.3.5选择性 不同来源的空白基质对分析物均无干扰；混合来源的空白基质、空白试剂溶液对分析物和内标的检测无干扰；内标对分析物、分析物对内标的检测无干扰，均符合接受标准。

2.3.6标准曲线与定量下限 在1.5 mL聚丙烯离心管中，用移液器加入适量空白人正常血浆。加入相应的源溶液，涡旋混匀(约30 s)，配制成相应的校正标样(5.00，10.0，20.0，50.0，200，500，900，1000 ng·mL-1)。按样本处理操作，以分析物(单硝酸异山梨酯)与内标(单硝酸异山梨酯-13C6)的色谱峰面积比对分析物浓度(权重1/X2)进行线性回归，得回归方程Y=0.005 09X+0.000 292，线性拟合度R2为0.997 0，线性范围为5.00～1 000 ng·mL-1，定量下限5.00 ng·mL-1。

2.3.7残留效应 在最高浓度的校正标样后连续分析两个空白基质样品来评价残留效应。在分析物保留时间处干扰峰的响应均低于定量下限中分析物响应的20%，内标保留时间处干扰峰的响应均低于零浓度样品中内标响应的5%。结果表明，最高浓度后面的2个空白基质样品均无峰面积，分析物与内标均无残留效应，不影响定量。

2.3.8基质效应 精密吸取单硝酸异山梨酯工作溶液和内标溶液，用乙腈-水(10：90)稀释，分别配制成分析物浓度为250，33.3，5.00 ng·mL-1，内标浓度均为62.5 ng·mL-1的3种浓度的纯溶液。含基质样品：精密移取血浆样品80.0 μL至96孔板中，加入内标工作溶液(浓度为600 ng·mL-1)25.0 μL，再加入乙酸乙酯800 μL，涡旋混合，在4 ℃ 1 700×g离心15 min；转移有机相500 μL至另一块96孔板中，由氮气吹干后加入上述3种纯溶液，涡旋混合5 min，取20.0 μL进样，每个浓度采用6个不同来源的基质配制平行样1个。不含基质样品：精密移取空白试剂80.0 μL至96孔板中，加入甲醇：水(50：50)25.0 μL，再加入乙酸乙酯800 μL，涡旋混合，在4 ℃ 1 700×g离心15 min；转移有机相500 μL至另一块96孔板中，由氮气吹干后加入上述3种纯溶液，涡旋混合5 min，取20.0 μL进样，每个浓度配制平行样3个。采用基质存在下的峰面积与不含基质的相应峰面积的比值分别计算分析物和内标的基质因子，对基质效应进行评价。内标归一化的基质因子其值越接近1，说明内标与分析物的基质效应越接近，基质效应不影响最终的准确定量分析。实验结果显示，低、中、高浓度的内标归一化的基质因子分别为1.03，0.981，1.02，RSD分别为3.1%，2.9%，2.6%，表明无明显基质效应。

2.3.9精密度与准确度 配制定量下限、低、中和高4个浓度的质控样品(分别为5.00，15.00，100，750 ng·mL-1)，按血浆样本处理操作，在3个分析批中，各浓度质控样品均配制平行样6个，评价本方法的精密度与准确度，结果见表1。

表1 人血浆中单硝酸异山梨酯含量测定的方法精度和准确度

2.3.10回收率 按血浆样本处理操作，最后不加入乙腈：水(10：90)150 μL，加入相应纯溶液，测定采用正常空白血浆(高脂空白血浆)配制成低、中、高浓度的质控样中分析物和内标峰面积，以及各浓度回收率评价中分析物和内标峰面积，计算回收率。结果见表2。

表2 人血浆中单硝酸异山梨酯含量测定的方法回收率

2.3.11稳定性 分别考察全血中分析物在室温(RSD≤2.3%)和湿冰(RSD≤5.8%)条件下放置2 h稳定性；血浆中分析物在室温下放置24 h稳定性(RSD≤6.3%)；处理过的样品在自动进样器(4 ℃)下存储72 h稳定性(RSD≤5.4%)；血浆中分析物经过5次冷冻和融化循环后稳定性(RSD≤5.5%)；血浆中分析物储存在-15～35 ℃条件下29d稳定性(RSD≤4.2%)，在-60～90 ℃条件下65 d稳定性(RSD≤2.5%)。结果表明单硝酸异山梨酯的血浆样品稳定性良好。

2.4血药浓度-时间曲线 空腹和餐后条件下各有28例健康受试者单剂量口服受试制剂和参比制剂，单硝酸异山梨酯血药浓度-时间曲线见图1。

图1 空腹(A)和餐后(B)口服受试制剂和参比制剂的平均血药浓度-时间曲线

2.5药动学参数 经WinNonlin 8.1版软件计算健康受试者空腹或餐后口服受试制剂和参比制剂后的药动学参数，见表3。采用非参数检验(Wilcoxon符号秩检验)评价受试制剂和参比制剂峰时间(tmax)的差异。

表3 健康受试者空腹或餐后条件下单次口服单硝酸异山梨酯缓释胶囊后PK参数

2.6生物等效性分析 将对数转换后的受试制剂和参比制剂的药动学参数峰浓度(Cmax)、血药浓度-时间曲线下面积(AUC0-t)、AUC0-∞进行方差分析，采用双向单侧t检验及(1-2α)置信区间(CI)法进行生物等效性评价，其中tmax采用非参数法(Wilcoxon符号秩检验)检验。结果表明，空腹试验中Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的90%置信区间分别为(99.91，105.55)%，(98.85，103.54)%，(98.89，103.70)%；餐后试验中Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的90%CI分别为(88.54，97.23)%，(95.21，99.48)%，(95.12，99.55)%。因此无论是在空腹还是餐后条件下，受试制剂与参比制剂的主要药代动力学参数Cmax、AUC0-t、AUC0-∞几何均数比值的90%置信区间均在80.00%～125.00%范围内，满足判定标准，表明空腹和餐后条件下口服受试制剂和参比制剂具有生物等效。

2.7安全性评价 空腹试验，不良事件主要包括头痛、头晕、血压降低等。共发生不良事件的例次为127，例数为27，发生率为96.4%，均为轻度。服用受试好。制剂阶段例次为60，例数为26，发生率为92.9%；服用参比制剂阶段例次为67，例数为26，发生率为92.9%；均无导致退出试验的不良事件发生，无严重不良事件发生。

餐后试验，不良事件主要包括头痛、头晕、血压降低、呕吐等。共发生不良事件的例次为169，例数为28，发生率为100.0%，严重程度均为轻度。服用受试制剂阶段例次为76，例数为26，发生率为92.9%；服用参比制剂阶段例次为93，例数为27，发生率为96.4%；均无导致退出试验的不良事件发生，无严重不良事件发生。

试验数据表明，健康受试者空腹和餐后条件下单次服用单硝酸异山梨酯缓释胶囊受试制剂和参比制剂后不良事件发生率基本一致，可认为受试制剂和参比制剂在健康成年受试者中安全性相当，耐受性良好。

3 讨论

本项研究中健康成年受试者在空腹条件或餐后条件下单次口服50 mg单硝酸异山梨酯缓释胶囊参比制剂和受试制剂后，血浆中单硝酸异山梨酯经对数转换的Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的90%CI在生物等效性评价接受的(80.00%，125.00%)范围内，基于临床试验数据可以判断，受试制剂与参比制剂在吸收速度及吸收程度上均无显著性差异，两制剂等效。