王彦平，娄芳慧，孙瑞琳，钱志伟*，汤高奇

（河南农业职业学院食品工程学院，河南郑州 451450）

白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种多酚类化合物，结构中含有芪类，在葡萄皮中其含量最高[1-2]。白藜芦醇的生理功能有很多，其中在肿瘤的抑制、血糖的调控、心脑血管的防护、抗氧化、衰老的延缓等方面尤其突出[3-10]。赤霞珠酿酒葡萄皮渣中含有丰富的白藜芦醇、原花青素、花青素、类黄酮等生理活性物质[11]，但一般被当作饲料、肥料，甚至被当作废料舍弃，其中所含有的多种有效成分未被利用，既造成了环境污染又浪费资源。白藜芦醇的浸提方式有很多，常用的有有机溶剂浸提法、超声波浸提法、微波浸提法、酶水解法等[12-16]。本试验在传统有机溶剂浸提法的基础上，使用双酶法（纤维素酶和果胶酶）辅助浸提并优化工艺参数，并测定该条件下所得白藜芦醇的体外抗氧化活性，以期为赤霞珠酿酒葡萄皮渣的高效应用开拓新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤霞珠酿酒葡萄皮渣：2019年河南省农业高新科技园。置于恒温箱中于45 ℃烘干48 h，粉碎后过50目筛，用索氏浸提器加入乙醚进行脱脂处理，封存待用。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）：美国安捷伦科技公司；BSA423S-CW分析天平：德国赛多利斯集团；JY-5002旋转蒸发器：青岛聚创环保集团有限公司；XZ-5MT离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；GWB-1E试验室专用超纯水机：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 双酶法辅助浸提白藜芦醇

准确称取5 g赤霞珠酿酒葡萄皮渣粉末至250 mL锥形瓶中，加入适量纤维素酶、果胶酶和50 mL超纯水，摇匀，调整pH至5.0，在适当的温度条件下水解，然后按照适当的液固比加入体积分数95%的乙醇，摇匀，75 ℃水浴浸提4 h。浸提液6 000 r/min离心15 min，上清液减压蒸馏后用体积分数95%的乙醇定容至25 mL。

1.3.2 单因素试验设计

设定纤维素酶和果胶酶添加量分别为2.0%、0.4%，酶解条件为45 ℃、120 min，液固比（乙醇∶葡萄皮渣）25∶1（mL∶g）为基本条件。分别改变纤维素酶添加量为0、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；果胶酶添加量为0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%；酶解时间为40 min、60 min、80 min、100 min、120 min；酶解温度为35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃；液固比（乙醇∶葡萄皮渣）为15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL∶g），以白藜芦醇得率为考察指标，研究各因素对赤霞珠酿酒葡萄皮渣白藜芦醇工艺的影响。

1.3.3 正交试验设计

在单因素试验的基础上，设计4因素3水平L9（34）正交试验确定双酶法浸提赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇的最佳工艺条件。正交试验因素与水平见表1。

经患者肘前静脉用装有5 ml枸橼酸钠抗凝剂的50 ml的一次性注射器抽取45 ml静脉血，摇匀后注入PRP套装离心管中，在严格无菌状态下以2 000 r/min离心2次，每次10 min，最后用无菌吸引管抽取最下层血浆约10 ml，即富血小板血浆备用。使用穿刺针将制备好的PRP注入膝关节腔（穿刺过程严格无菌操作），每一侧注射量为3～4 ml（量多了局部有疼痛感），连续注射3次，每次间隔一周，术后辅以全面系统化的护理和康复锻炼，患者均于术后1个月、2个月、3个月复查膝关节磁共振了解膝关节关节软骨情况。

表1 赤霞珠酿酒葡萄皮渣白藜芦醇浸提工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for resveratrol extraction process optimization from Cabernet Sauvignon wine residue

1.3.4 测定方法

白藜芦醇的标准曲线绘制及得率测定：准确称取白藜芦醇标准品（干燥至恒质量）20 mg，使用甲醇-水溶液（60∶40，V/V）溶解并定容至10 mL，摇匀配制成2 mg/mL的白藜芦醇储备液，4 ℃冰箱保存。分别量取定量的标准品储备液配制成质量浓度分别为2.5μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的白藜芦醇溶液。采用HPLC法[17]测定，得回归方程：y=150 766x+509 796，相关系数R2=0.999 9。

称量5份5 g赤霞珠酿酒葡萄皮渣粉，按最佳浸提工艺浸提，将浸提液于离心机中6 000 r/min离心20 min，旋转蒸发浓缩之后将其定容至25 mL。依据1.3.1色谱条件检测，从而进一步获得赤霞珠酿酒葡萄皮渣白藜芦醇的得率，其计算公式如下：

赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇得率（μg/g）=白藜芦醇质量（μg）/赤霞珠酿酒葡萄皮渣粉末质量（g）

赤霞珠酿酒葡萄皮渣白藜芦醇的体外抗氧化活性：最佳条件下得到的赤霞珠酿酒葡萄皮渣白藜芦醇浸提液，参照文献[18-19]的方法分别测定其DPPH自由基（DPPH·）清除率、羟基自由基（·OH）清除率，并以维生素C（vitamin C，VC）作阳性对照。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 纤维素酶添加量对白藜芦醇浸提工艺的影响

图1 纤维素酶添加量对白藜芦醇得率的影响Fig.1 Effect of cellulase addition on the yield of resveratrol

从图1可以看出，赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇得率随着纤维素酶添加量的增加呈先升高后趋于平缓的趋势。纤维素酶添加量为2.0%时，白藜芦醇的得率到达最高值，为（861.4±6.71）μg/g；纤维素酶添加量为2.5%时，白藜芦醇的得率与0.20%样品组无明显差异（P＞0.05）。故选择纤维素酶添加量为1.5%～2.5%进行后续试验。

2.1.2 果胶酶添加量对白藜芦醇得率的影响

图2 果胶酶添加量对白藜芦醇得率的影响Fig.2 Effect of pectase addition on the yield of resveratrol

从图2可以看出，果胶酶添加量在0～1.6%试验范围内，赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇的得率呈先上升后稍微下降的趋势。果胶酶添加量为1.2%时，白藜芦醇得率到达最高值，为（889.1±6.71）μg/g；果胶酶添加量为1.6%时，赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇得率与1.2%样品组无明显差异（P＞0.05）。原因可能是酶浓度达到一定值后，底物浓度相对不能饱和，导致酶作用受阻[20]。同时，结果表明双酶法浸提赤霞珠酿酒葡萄皮渣白藜芦醇得率高于单一纤维素酶浸提法得率（P＜0.05）。故选择果胶酶添加量为0.8%～1.6%进行后续试验。

2.1.3 酶解时间对白藜芦醇得率的影响

图3 酶解时间对白藜芦醇得率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on the yield of resveratrol

从图3可以看出，随着酶解时间的延长，赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇得率呈先升高后平稳的趋势。酶解时间为100 min时，白藜芦醇得率达到较高值，为（881.5±5.73）μg/g；酶解时间延长至120 min时，赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇的得率略有上升，但与100 min样品组无明显差异（P＞0.05）。故选取酶解时间在80～120 min进行后续试验。

2.1.4 酶解温度对白藜芦醇得率的影响

图4 酶解温度对白藜芦醇得率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the yield of resveratrol

从图4可以看出，赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇得率随着酶解温度的升高呈先升高后下降的趋势。酶解温度为45 ℃时，白藜芦醇的得率达到最高值，为（891.9±4.98）μg/g；酶解温度为50 ℃时，白藜芦醇的得率与45 ℃样品组无明显差异（P＞0.05）；温度升至55 ℃时，白藜芦醇的得率与45 ℃样品组有明显差异（P＜0.05）。可能由于过高的温度可能导致酶的活性衰减，而使酶解反应难以充分进行，试验过程中获得的白藜芦醇得率也有一定程度的下降。故选择酶解温度为45～55 ℃进行后续试验。

2.1.5 液固比对白藜芦醇得率的影响

图5 液固比对白藜芦醇得率的影响Fig.5 Effect of liquid to solid ratio on the yield of resveratrol

从图5可以看出，赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇得率随着液固比的增加呈先升高后趋于平缓的趋势。当液固比为30∶1（mL∶g）时，白藜芦醇得率达到最高值，为（896.7±4.66）μg/g。随着液固比值的上升使得白藜芦醇与溶剂的接触面积增大，进而促使赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇的溶出。液固比升高至35∶1（mL∶g），白藜芦醇得率与30∶1（mL∶g）的样品组相比无明显差异（P＞0.05）。故选择液固比为30∶1（mL∶g）进行后续试验。

2.2 正交试验结果

表2 赤霞珠酿酒葡萄皮渣白藜芦醇浸提工艺优化正交试验结果Table 2 Result of orthogonal tests for resveratrol extraction process optimization from Cabernet Sauvignon wine residue

由表2可以看出，影响白藜芦醇得率的4个因素大小依次为D＞A＞B＞C，即酶解温度＞纤维素酶添加量＞果胶酶添加量＞酶解时间。最优方案为A3B2C2D2，即纤维素酶添加量2.5%，果胶酶添加量1.2%，酶解温度45 ℃，酶解时间100 min。在此条件下赤霞珠酿酒葡萄皮渣白藜芦醇的平均得率为（927±4.11）μg/g。

2.3 赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇的体外抗氧化活性

2.3.1 对DPPH·的清除作用

图6 赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇对DPPH·的消除作用Fig.6 Scavenging effect of resveratrol from Cabernet Sauvignon wine residue on DPPH free radical

由图6可以看出，赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇对DPPH·的半抑制浓度（50%inhibitory concen traton，IC50）值为0.164 mg/mL，VC的IC50值为0.224 mg/mL。赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇对DPPH·的消除能力高于VC。

图7 赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇对OH·的消除作用Fig.7 Scavenging effect of resveratrol from Cabernet Sauvignon wine residue on OH free radical

2.3.2 对·OH的清除作用

由图7可以看出，赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇对·OH的IC50值为0.282 mg/mL，VC的IC50值为0.340 mg/mL。赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇对·OH的消除能力高于VC。

3 结论

本研究以酿酒赤霞珠酿酒葡萄皮渣为原料，优化了双酶法（纤维素酶和果胶酶）辅助浸提赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇的浸提工艺，得到的最佳工艺条件为：纤维素酶和果胶酶加入量分别为2.5%和1.2%，酶解时间100 min、酶解温度45 ℃、液固比为30∶1（mL∶g）。在最优条件下，赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇的得率是（927±4.11）μg/g，此结果要高于单一使用纤维素酶浸提法得率或者单一使用果胶酶浸提法得率。体外抗氧化试验数据可以得出，赤霞珠酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇消除DPPH·和·OH的能力较高，其抗氧化作用也高于VC，并且抗氧化作用与白藜芦醇的含量呈正相关，作为天然抗氧化物，值得进一步研究和开发。