刘猛 ，樊凤娇，刘新民，赵辉

1. 吕梁学院生命科学系（吕梁 033000）；2. 山西省特色植物功能成分工程研究中心（吕梁 033000）；3. 南京财经大学食品科学与工程学院（南京 210023）

核桃也称为山核桃和胡桃，是一种医药与食用价值较高的油作物[1]，食用核桃可降低胆固醇吸收、降低心血管疾病的发病率等[2-6]。经研究，核桃蛋白中含有生物活性肽成分，具有吸收快、消耗低、数量多的特点[7-11]。因此开发核桃资源、研究核桃蛋白功能特性极为重要[12]。

易建华等[13]用蛋白酶水解核桃蛋白，得出复合酶对核桃蛋白作用明显。姜莉等[14]采用胰蛋白酶酶解核桃蛋白，提取核桃中的多肽。崔莉等[15]研究温度对核桃蛋白的影响，得出核桃蛋白具有热敏性，其最适宜变性温度为67.05 ℃，相比植物蛋白变性温度较低。核桃蛋白在稀碱溶液中溶解性较好，且不溶于水，其等电点在pH 5左右，随着温度的升高，其溶解度增大，当温度为55 ℃时，其溶解度达到最大。在略低于变性温度，蛋白质的乳化能力及乳化稳定性增加时，温度也随着升高[16]。齐西婷等[17]利用水剂法酶解中性蛋白酶中的核桃粗蛋白，以VC为对照进行试验，分析核桃粗蛋白水解产物的体外抗氧化性。毛晓英[18]在核桃脱脂粉的溶解性分析中表明，核桃蛋白溶液中的溶解度较之于乙醇溶液中的溶解度略高。

试验采用碱溶酸沉法提取核桃粕分离蛋白，通过单因素试验研究酶解温度、pH、酶解时间和酶添加量对核桃蛋白水解度的影响，采用正交试验进行优化，得到碱性蛋白酶水解核桃蛋白的最佳水解条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃粕（山西圣府第油脂有限公司）；碱性蛋白酶（北京奥博兴生物技术有限公司）；盐酸（福州飞净生物科技有限公司）；甲醛溶液（天津市致远化学试剂有限公司）；氢氧化钠（河南爱典化工有限公司）；PBS磷酸盐缓冲液（杭州永星五交化有限公司）。

1.2 仪器与设备

PHBJ-260便携式pH计（上海仪电科学仪器有限公司）；HH-6恒温水浴锅（国华电器有限公司）；TDL-40B高速离心机（湖南湘仪仪器开发有限公司）；JD200-3电子天平（赛多利科学仪器有限公司）；85-1恒温磁力搅拌器（金坛市普瑞斯机械有限公司）；H29527超声提取器（北京恒奥德仪器有限公司）；EPOCH2型酶标仪（北京瑞利分析仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 核桃蛋白的制备[19]

称取100 g核桃粕于2 000 mL烧杯中，加2 000 mL蒸馏水，混匀，用1 mol/L NaOH调节pH至9.0，混匀，于50 ℃超声提取（超声功率250 W）1 h，静置30min，以3 000 r/min离心20 min，上清液用1 mol/L HCl调节pH至4.5，搅拌，静置30 min，以3 000 r/min离心20 min，沉淀层用去离子水洗至中性，在3 000 r/min条件下离心20 min，冷冻干燥，即得核桃饼粕分离蛋白。

1.3.2 核桃蛋白酶解液蛋白质含量的测定

采用BCA法[20]测定蛋白质含量。

1.3.3 核桃蛋白水解度的测定

采用甲醛滴定法[21]测定水解度。取5 mL核桃蛋白水解液，加25 mL去离子水，恒温磁力搅拌15 min，用0.05 mol/L NaOH标准溶液调整pH至8.2，加10 mL中性甲醛溶液，混匀，用0.05 mol/L NaOH溶液调整pH至9.2，记录消耗的氢氧化钠体积。另取30 mL去离子水，做空白试验。试样中氨基氮含量按式（1）计算。

式中：X为试样中氨基氮含量，g/mL；V1为试样中加入甲醛溶液后消耗NaOH标准液的体积，mL；V2为空白试验加入甲醛溶液后消耗NaOH标准液的体积，mL；V3为试样稀释液用量，mL；C为试样中NaOH标准液的浓度，mol/L；0.014为氮的毫克当量。

总氮量乘以氮的换算系数6.25为蛋白质含量。氨基氮含量与总氮含量的比值为水解度。

1.4 单因素试验

1.4.1 酶解过程中温度对核桃蛋白水解度的影响

分别取5 mL核桃分离蛋白溶液于5支试管中，加10 000 U/g碱性蛋白酶，调整pH至9.0，分别在温度35，40，45，50和55 ℃条件下恒温水解6 h。以蒸馏水代替核桃分离蛋白溶液为零管，记录试验数据。根据不同酶解温度对核桃蛋白水解度的影响进行分析，得出最适的温度。

1.4.2 酶解过程中pH对核桃蛋白水解度的影响

分别取5 mL核桃分离蛋白溶液于5支试管中，加10 000 U/g碱性蛋白酶，分别在pH 8，8.5，9，9.5和10，温度50 ℃条件下恒温水解6 h。以蒸馏水代替核桃分离蛋白溶液为零管，记录试验数据。根据不同pH对核桃蛋白水解度的影响进行分析，得出最适的pH。

1.4.3 酶解过程中时间对核桃蛋白水解度的影响

分别取5 mL核桃分离蛋白溶液于5支试管中，加10 000 U/g碱性蛋白酶，调整pH至9.0，分别在50 ℃恒温水浴中分别水解3，4，5，6和7 h。以蒸馏水代替核桃分离蛋白溶液为零管，记录试验数据。根据不同酶解时间对核桃蛋白水解度的影响进行分析，得到最适的时间。

1.4.4 酶解过程中酶添加量对核桃蛋白水解度的影响

分别取5 mL核桃分离蛋白溶液于5支试管中，调整pH至9.0，加入碱性蛋白酶，加酶量分别为4 000，6 000，8 000，10 000和12 000 U/g，于50 ℃恒温水解6 h。以蒸馏水代替核桃分离蛋白溶液为零管，记录试验数据。根据不同酶添加量对核桃蛋白水解度的影响进行分析，得到最适的加酶量。

1.5 正交试验

根据单因素试验结果，分别选取每个变量的3个最优水平，按表1进行正交试验，确定碱性蛋白酶对核桃蛋白的最佳水解条件。

表1 正交试验设计

1.6 数据统计与分析

利用软件记录试验数据，计算核桃蛋白的水解度，并用Origin软件绘图。正交试验设计和结果采用正交设计助理IIV 3.1进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 核桃蛋白中蛋白质的含量的测定

BCA法测定蛋白质浓度标准曲线如图1所示。线性回归方程为y=0.897 37x+0.078 46，R2=0.996 78。

图1 蛋白质标准曲线

2.2 温度对核桃蛋白水解度的影响

如图2所示，在35，40，45和50 ℃时，随温度的升高，水解度呈上升趋势，在50 ℃时达到最高值，在50～55 ℃时逐渐趋于平缓。酶促反应与其他化学反应相同，随温度的升高，反应速率随之增强。故核桃蛋白水解反应最适酶解温度为50 ℃。

图2 酶解温度对核桃蛋白水解度的影响

2.3 pH对核桃蛋白水解度的影响

如图3所示，随pH的增加，水解度呈上升趋势，达到最高点后缓慢下降，当pH为9时水解度达到最高值。过酸、过碱均造成酶空间结构的破坏，甚至使酶变性而丧失活力。由此得出核桃蛋白水解反应最适pH为9。

图3 pH对核桃蛋白水解度的影响

2.4 酶解时间对核桃蛋白水解度的影响

如图4所示，随酶解时间的增加，水解度呈上升趋势，在3～5 h时水解度随时间增加而增大，在5～6 h时达到最高点，在6～7 h时水解度随时间的增加呈平缓趋势。由此得出核桃蛋白水解反应最适酶解时间为6 h。

图4 酶解时间对核桃蛋白水解度的影响

2.5 酶添加量对核桃蛋白水解度的影响

如图5所示。酶添加量在4 000～8 000 U/g时，水解度随加酶量的增加而升高；当酶添加量为10 000 U/g时，水解度达到最高值；在10 000～12 000 U/g之间，水解度趋于平缓趋势。由此得出核桃蛋白水解反应的最适加酶量为10 000 U/g。

图5 酶添加量对核桃蛋白水解度的影响

2.6 正交试验结果与分析

由表2可知，影响核桃蛋白水解的各因素主次顺序为C＞D＞B＞A，即酶解时间＞酶添加量＞pH＞酶解温度。根据正交试验设计和结果可得5号A2B3C1D2为最优方案，即核桃蛋白的最佳水解条件为酶解时间5 h、酶添加量10 000 U/g、pH 9.5、酶解温度50 ℃；最佳水解度为21.2%。水解度越大，水解条越好。

表2 正交试验结果和极差分析

由表3可知：当p＜0.05时，以酶解温度为误差项，经方差分析，得出酶解时间和酶添加量对核桃蛋白水解度的影响差异显著，pH与温度对其影响差异不显著。

表3 正交试验结果方差分析

3 结论

试验采用碱溶酸沉法提取核桃粕核桃蛋白，用甲醛滴定法测定核桃蛋白的水解度，以水解度为指标，对不同酶解温度、pH、酶解时间和酶添加量对水解度的影响进行单因素试验，并通过正交试验对其进行优化。最终确定的核桃蛋白最佳水解条件为酶解时间5 h、酶添加量10 000 U/g、pH 9.5、酶解温度45 ℃，其最佳水解度达到21.2%。试验为核桃蛋白的深加工和利用、开发相关功能性食品提供一定的理论依据。