杨昭，曾琳琦，凌叶婷，莫芷晴，何春兰

广东食品药品职业学院（广州 510520）

水产品营养价值高，特征性风味突出，由其制备的调味料可满足消费者对食品健康和营养的需求，具有广阔的市场前景[1]。我国拥有丰富的水产品资源，利用水产品制备高品质海鲜调味料是我国调味品发展的一个重要趋势[2]。

广东省是龟鳖养殖和消费大省。中华草龟（Chinemys reevesiis）、中华花龟（Ocadia sinensis）和鳄龟（Chelydra serpentina）为广东省重要的大宗养殖龟类品种[3]。中华草龟、中华花龟和鳄龟均含有丰富的蛋白质，味道鲜美，一般以鲜食为主，现有研究集中于营养成分分析和生物活性肽制备，未有酶解制备呈味基料的报道[4-5]。碱性蛋白酶有较强的蛋白质水解能力，被广泛应用于水产品调味料的制备[6-8]。胰蛋白酶具有较强的水解能力，风味蛋白酶的酶解液具有较好的感官品质。胰蛋白酶和风味蛋白酶组成复合蛋白酶进行酶解，不仅水解效率高，而且可以获得品质较佳的酶解液，已在在水产品酶解液的制备过程中广泛应用[9]。

因此，为探究蛋白酶种类对3种龟肉酶解液品质的影响，采用碱性蛋白酶和复合蛋白酶对中华草龟、中华花龟和鳄龟肉进行水解，考察其对酶解液感官品质、蛋白质含量、蛋白质回收率、肽的分子质量分布和抗氧化活性的影响，以期为龟肉资源的深加工和高值化利用提供理论基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中华草龟、中华花龟、鳄龟，产自广东肇庆，均为人工室外养殖，宰杀后取出可食用部位肉，于-18℃冻存；风味蛋白酶（酶活 500 LAPU/g）：诺维信中国公司；碱性蛋白酶（酶活20万 U/g）、胰蛋白酶（酶活 4 000 U/g）：重庆市全新祥盛生物制药有限公司；卵清蛋白（43 000 Da）、细胞色素C（12 384 Da）、抑肽酶（6 512 Da）、维生素B12（1 355 Da）、氨基酸混合标准品：美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为分析纯。

TSK gel G2000 SWXL色谱柱（300 mm×7.8 mm，5 μm，东曹（上海）生物科技有限公司）；LC-20A高效液相色谱仪（配PDA检测器，日本岛津制作所）；K9840凯氏定氮仪（济南海能仪器股份有限公司）；DKZ-3B电热恒温振荡水槽（上海一恒科学仪器有限公司）；3K15台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 龟肉酶解液制备

龟肉碱性蛋白酶酶解液制备：取适量冰冻中华草龟肉，室温解冻后，用绞肉机将其搅碎成糜状。准确称取40 g肉糜，加入320 g蒸馏水，搅拌均匀后，调整浆液pH至8.0，加入1%的碱性蛋白酶，迅速搅拌均匀后，在60 ℃水浴摇床中水解3 h。待水解结束，在沸水浴中煮沸灭酶20 min，冷却后，在8 000 r/min 4 ℃条件下离心20 min，收集上清液，即为中华草龟肉碱性蛋白酶酶解液，记为ACRH。中华花龟肉和鳄龟肉碱性蛋白酶酶解液制备方法与上述方法相同，分别记为AOSH和ACSH。

龟肉复合蛋白酶酶解液制备：取适量冰冻中华草龟肉，室温解冻后，用绞肉机将其搅碎成肉糜状。准确称取40 g肉糜，加入320 g蒸馏水，搅拌均匀后，调整浆液pH至7.0，加入0.3%的风味蛋白酶和0.6%的胰蛋白酶，迅速搅拌均匀后，在55 ℃水浴摇床中水解3 h。待水解结束，在沸水浴中煮沸灭酶20 min，冷却后，在8 000 r/min 4 ℃条件下离心20 min，收集上清液，即为中华草龟肉复合蛋白酶酶解液，记为CCRH。中华花龟肉和鳄龟肉复合蛋白酶酶解液制备方法与上述方法相同，分别记为COSH和CCSH。

1.2.2 酶解液的感官评价

参照邓嫣容[10]的方法进行酶解液的感官评价，分别对酶解液的滋味、风味和外观形态进行打分，感官评价标准如表1所示。感官评价小组由10名受过感官分析培训的学生组成（5名男性和5名女性，年龄16-20岁）。感官评价在标准感官评价室进行，选用白光作为光源。

表1 龟肉酶解液感官评价标准

1.2.3 酶解液蛋白质含量及回收率[11]

采用凯氏定氮法测定龟肉原料和酶解液中的总氮含量。按式（1）计算蛋白质回收率。

1.2.4 酶解液肽的分子质量分布

采用高效液相色谱仪对酶解液肽的分子质量分布进行检测[12]。用流动相将2 mL酶解液在10 mL容量瓶中定容，用0.22 μm微孔滤膜过滤后供进样。标准肽样品为卵清蛋白（43 000 Da）、细胞色素C（12 384 Da）、抑肽酶（6 512 Da）和维生素B12（1 355 Da）。检测波长为220 nm，柱温箱温度为30 ℃，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL。流动相为乙腈-超纯水-三氟乙酸（体积比为45∶55∶0.1）。

1.2.5 酶解液抗氧化活性分析

酶解液用蒸馏水稀释3倍后，取2.0 mL稀释样品溶液于离心管中，依次加入2.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和2.0 mL 8 mmol/L H2O2溶液，混匀，于37 ℃水浴10 min，再加入2.0 mL 6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，混匀，于37 ℃水浴30 min，在510 nm波长处测定吸光度。用蒸馏水做空白对照[13-14]。羟自由基清除率按式（2）计算。

式中：A1为2.0 mL样品溶液+2.0 mL FeSO4溶液+2.0 mL H2O2溶液+2.0 mL水杨酸-乙醇溶液的吸光度；A2为2.0 mL样品溶液+2.0 mL FeSO4溶液+2.0 mL无水乙醇+2.0 mL水杨酸-乙醇溶液的吸光度；A3为2.0 mL蒸馏水+2.0 mL FeSO4溶液+2.0 mL H2O2溶液+2.0 mL水杨酸-乙醇溶液的吸光度。

1.3 数据处理

所有测定均进行3次重复试验，取平均值。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶种类对龟肉酶解液感官的影响

酶解液的感官对其应用有重要影响，通常作为呈味基料的酶解液，应具备较强的鲜味、无苦味和无异味，具有特征性风味。酶解液的滋味特性与蛋白酶的种类、酶解条件（温度、pH、水解程度和料液比等）、底物（肉的种类、预处理方式）有关[15]。由图1可知，碱性蛋白酶和复合蛋白酶对中华草龟、中华花龟和鳄龟肉酶解液的感官分值有较大影响。6种酶解液感官分值从大到小分别是ACRH、ACSH、COSH、CCSH、CCRH和AOSH。ACRH的感官分值最高，为92.0分，其酶解液呈现澄清、浅黄色、无腥味、强烈鲜味和浓郁肉香味。表明中华草龟肉经碱性蛋白酶处理，其酶解液具有较佳的感官分值。AOSH的感官分值最低，为72.5分，其酶解液有较强腥味，且滋味淡，风味差，溶液浑浊。经碱性蛋白酶处理，酶解液感官分值从大到小的龟肉品种分别是中华草龟（92.0分）、鳄龟（85.8分）和中华花龟（72.5分）。经复合蛋白酶处理，酶解液感官分值从大到小的龟肉品种分别是中华花龟（84.8分）、鳄龟（83.0分）和中华草龟（77.5分）。

2.2 蛋白酶种类对龟肉酶解液蛋白质含量及回收率的影响

蛋白质含量是酶解液重要的营养指标。由图2可知，碱性蛋白酶和复合蛋白酶对中华草龟、中华花龟和鳄龟肉酶解液的蛋白质含量有较大影响。6种酶解液蛋白质含量从大到小分别是AOSH、COSH、CCSH、CCRH、ACRH和ACSH。AOSH的蛋白质含量最高，为0.718 g/100 g；ACSH的蛋白质含量最低，为0.520 g/100 g。经碱性蛋白酶处理，酶解液蛋白质含量从大到小的龟肉品种分别是中华花龟（0.718 g/100g）、中华草龟（0.569 g/100 g）和鳄龟（0.520 g/100 g）。经复合蛋白酶处理，酶解液蛋白质含量从大到小的龟肉品种分别是中华花龟（0.700 g/100 g）、鳄龟（0.639 g/100 g）和中华草龟（0.597 g/100 g）。

图1 蛋白酶种类对龟肉酶解液感官分值的影响

图2 蛋白酶种类对龟肉酶解液蛋白质含量的影响

图3 蛋白酶种类对龟肉酶解液蛋白质回收率的影响

由图3可知，碱性蛋白酶和复合蛋白酶对中华草龟、中华花龟和鳄龟肉酶解液的蛋白质回收率影响较大。6种酶解液蛋白质回收率从大到小分别是AOSH、COSH、CCRH、CCSH、ACRH和ACSH。AOSH的蛋白质回收率最高，为38.54%；ACSH的蛋白质回收率最低，为24.85%。经碱性蛋白酶处理，酶解液蛋白质回收率从大到小的龟肉品种分别是中华花龟（38.54%）、中华草龟（27.89%）和鳄龟（24.85%）。经复合蛋白酶处理，酶解液蛋白质回收率从大到小的龟肉品种分别是中华花龟（34.53%）、中华草龟（29.97%）和鳄龟（29.19%）。中华花龟肉碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解液的蛋白质含量和蛋白质回收率均最高，表明中华花龟肉可能更容易受到这2种蛋白酶的水解。

2.3 蛋白酶种类对龟肉酶解液肽的分子质量分布的影响

酶解液的呈味特性、功能特性、营养价值和生物活性等性质与其所含的小分子肽密切相关。Ogasawara等[16]发现大豆水解液中分子质量为1 000～5 000 Da的肽具有明显的鲜味。韩国豆酱水提物中鲜味最强的组分是分子质量为500～1 000 Da的短肽[17]。因此探究蛋白酶种类对龟肉酶解液肽的分子质量分布的影响有重要意义。由图4可知，6种龟肉酶解液蛋白均含有丰富的小肽，特别是小于1 000 Da的小肽。小于1 000 Da肽面积百分比最高的是COSH（97.10%），最低的是ACRH（71.11%）。1 000～2 000 Da肽面积百分比最高的是ACRH（18.73%），最低的是COSH（1.53%）。通常认为小于2 000 Da的肽都可能具有较强的呈味特性和生物活性，分析龟肉酶解液中小于2 000 Da肽的分子质量分布对了解其组成和活性有一定的指导意义。经碱性蛋白酶处理，酶解液中小于2 000 Da肽面积百分比从大到小的龟肉品种分别是中华花龟（92.01%）、鳄龟（91.45%）和中华草龟（89.84%）。经复合蛋白酶处理，酶解液中小于2 000 Da肽面积百分比从大到小的龟肉品种分别是中华花龟（98.64%）、鳄龟（97.19%）和中华草龟（96.42%）。

图4 蛋白酶种类对龟肉酶解液肽的分子质量分布的影响

2.4 蛋白酶种类对龟肉酶解液抗氧化活性的影响

羟自由基清除率是抗氧化活性评价的重要方法之一。羟自由基是细胞内反应活性最强的氧族自由基。在金属离子存在的条件下，羟自由基可由超氧阴离子和过氧化氢作用产生。它能与生物体内蛋白质、多肽和DNA等物质发生反应，对生物大分子产生最强的氧化破坏效应，引起细胞与组织的氧化损伤，导致器官的病变和机体的衰老[14]。由图5可知，碱性蛋白酶和复合蛋白酶对中华草龟、中华花龟和鳄龟肉酶解液的羟自由基清除率影响较大。6种酶解液蛋白质回收率从大到小分别是COSH、AOSH、ACRH、ACSH、CCSH和CCRH。COSH的羟自由基清除率最大，为59.70%；CCRH的羟自由基清除率最小，为33.03%。经碱性蛋白酶处理，酶解液羟自由基清除率从大到小的龟肉品种分别是中华花龟（54.72%）、中华草龟（53.63%）和鳄龟（50.77%）。经复合蛋白酶处理，酶解液羟自由基清除率从大到小的龟肉品种分别是中华花龟（59.70%）、中华草龟（33.03%）和鳄龟（37.07%）。中华花龟肉碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解液的羟自由基清除率均最高，表明中华花龟肉可能是较佳的抗氧化肽筛选的原料。

图5 蛋白酶种类对龟肉酶解液羟自由基清除率的影响

3 结论

此次试验采用碱性蛋白酶和复合蛋白酶对中华草龟、中华花龟和鳄龟肉进行酶解，考察其对酶解液感官、蛋白质含量、蛋白质回收率、肽的分子质量分布和抗氧化活性的影响。结果表明：ACRH的感官分值最高，为92.0分，其酶解液呈现澄清、浅黄色、无腥味、强烈鲜味和浓郁肉香味。AOSH的蛋白质含量和蛋白质回收率均最高，分别为0.718 g/100 g和38.54%。COSH的小于1 000 Da和小于2 000 Da肽面积百分比均最高，分别为97.10%和98.64%。COSH的羟自由基清除率最大，为59.70%。综合考虑，COSH的感官分值为84.8分，具有肽面积百分比最高的小分子肽，且具有最大的羟自由基清除率，表明中华花龟肉复合蛋白酶酶解液可能具有较大的研究价值和开发前景，后续可以继续深入研究其酶解条件优化和功能性肽的挖掘与鉴定。