邓仕彬，林国荣，林授锴，潘梦柔

莆田学院环境与生物工程学院，枇杷种质资源创新与利用福建省高校重点实验室（莆田 351100）

萝卜自古以来就有“小人参”的佳誉，是我国餐桌上的常客，作为一种十字花科植物，在我国被广泛种植，品种繁多。红心萝卜（Red radish，学名Raphanus sativusvar. Chinese red meat）是萝卜品种之一，成本低，来源丰富，表皮呈红色或绿色，果肉通红，肉质酥脆爽口，富含花青素，可用于提取营养价值高、安全系数大的天然萝卜红色素，逐渐取代合成色素[1]，被广泛用于食品[2]、化妆品[3]和医药[4]等领域。但萝卜红色素提取过程中会破坏萝卜组织，导致萝卜中的硫苷被内源黑芥子酶水解，形成有异味的小分子含硫化合物，从而使萝卜红色素产生强烈的刺激性气味和臭味[5]。这些异味物质包括异硫氰酸酯、硫氰酸酯、二氧化硫、硫化氢等，其中又以异硫氰酸酯为主要成分[6]。萝卜红色素异味的存在降低了产品品质，严重制约了其在食品中的应用与发展。

目前国内萝卜红色素脱味的生产方法主要是利用树脂除去硫苷，集中于对萝卜红色素进行后期脱味处理[7]。但国际上对色素的生产手段有严格限制，利用树脂进行纯化的方法普遍认为是不安全的，因此不适宜作为提取无异味萝卜红色素的方法。而其他诸如水蒸气蒸馏法[8]、酶解法[5]、膜分离法[9]、超临界CO2萃取[10]等方法，则面临着生产危险系数较高、能耗较大、成本高、膜回收利用困难等问题，不适于进行大规模的工业化生产。因此，寻求一种异味脱除效果好，又能用于工业化生产的高品质萝卜红色素提取工艺显得至关重要。

研究针对这些问题入手，采用多种适用于工业化生产的提取方法，并在保证萝卜红色素提取率的前提下，尝试多种提取方法的结合，从而在色素提取过程中减少或消除萝卜红色素中的异味成分，以期达到较好的除味效果，生产出优质的无异味萝卜红色素。通过比较不同提取方法对萝卜色素提取量和除臭程度的影响，确定出最优的提取工艺，可为无异味萝卜红色素的工业化生产提供思路，并进一步开发萝卜红色素的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象

新鲜红心萝卜，市售。

1.1.2 主要试剂

柠檬酸、盐酸、氢氧化钠、氯化钾、醋酸钠、醋酸、正己烷、烯丙基异硫氰酸酯、吗啉、丙酮、甲基红、溴甲酚绿、盐酸，以上试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器与设备

TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；ST3100型pH计，奥豪斯仪器有限公司；JYL-CO12型榨汁机，山东九阳股份有限公司；AR124CN型电子天平，奥豪斯仪器有限公司；SH8-III循环水式多用真空泵，西安常仪仪器设备有限公司；J-HH-6A型电热恒温水浴锅，上海盛卫有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 萝卜红色素提取方法

1.2.1.1 鲜切萝卜提取萝卜红色素

取新鲜红心萝卜，洗净去皮，分割成厚度2～3 nm的萝卜片，准确称取25 g，进行榨汁处理，分别收集榨汁液和残渣。将残渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入去离子水，在45 ℃条件下搅拌浸提2 h，使用抽滤装置进行抽滤，收集浸提液，最后将榨汁液与浸提液混合，定容至250 mL，保存待测。

1.2.1.2 热烫处理提取萝卜红色素

准确称取25 g萝卜片，立即置于50 mL沸水中热烫10 min，冷却后，将萝卜片进行榨汁处理，分别收集热烫汁液、榨汁液和残渣。将残渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入去离子水，在45 ℃条件下搅拌浸提2 h，使用抽滤装置进行抽滤，收集浸提液，最后将热烫汁液、榨汁液与浸提液混合，定容至250 mL，保存待测。

1.2.1.3 酸性水溶液提取萝卜红色素

准确称取25 g萝卜片，进行榨汁处理，分别收集榨汁液和残渣。将残渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入1%柠檬酸水溶液，使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH调pH至2.5，在45 ℃条件下搅拌浸提2 h，使用抽滤装置进行抽滤，收集浸提液，最后将榨汁液与浸提液混合，定容至250 mL，保存待测。

1.2.1.4 两相法提取萝卜红色素

准确称取25 g萝卜片，进行榨汁处理，分别收集榨汁液和残渣。将残渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入去离子水，在45 ℃条件下搅拌浸提2 h，使用抽滤装置进行抽滤，收集浸提液，最后将榨汁液与浸提液混合，以之前所加入的去离子水1∶1的比例加入正己烷溶液，将混合物在45 ℃下搅拌并萃取1 h，倒入分液漏斗中并静置30 min。取出下相液，定容至250 mL，保存待测。

1.2.2 酸提法单因素试验对提取萝卜红色素的影响

1.2.2.1 不同提取温度的影响

提取方法见1.2.1.3，提取温度分别设定为15，25，35，45，55和65 ℃。

1.2.2.2 不同提取时间的影响

提取方法见1.2.1.3，设定提取时间为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h。

1.2.2.3 不同料液比的影响

提取方法见1.2.1.3，将残渣分别以料液比1∶3，1∶5，1∶7，1∶9和1∶11（g/mL）的比例加入1%柠檬酸水溶液。

1.2.2.4 不同提取pH的影响

提取方法见1.2.1.3，浸提pH分别调至2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0和5.5。

1.2.3 提取组合方式对萝卜红色素含量的影响

1.2.3.1 酸性水热烫法提取萝卜红色素

准确称取25 g萝卜片，立即置于50 mL煮沸的1%柠檬酸水溶液中热烫10 min，冷却后，将萝卜片进行榨汁处理，分别收集热烫汁液、榨汁液和残渣。将残渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入1%柠檬酸水溶液，使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH调pH至2.5，在45℃条件下搅拌浸提2 h，使用抽滤装置进行抽滤，收集浸提液，最后将热烫汁液、榨汁液与浸提液混合，定容至250 mL，保存待测。

1.2.3.2 酸性水两相法提取萝卜红色素

准确称取25 g萝卜片，进行榨汁处理，分别收集榨汁液和残渣。将残渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入1%柠檬酸水溶液，使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH调pH至2.5，在45 ℃条件下搅拌浸提2 h，使用抽滤装置进行抽滤，收集浸提液，最后将榨汁液与浸提液混合，以之前所加入的1%柠檬酸水溶液1∶1的比例加入正己烷溶液，将混合物在45 ℃下搅拌并萃取1 h，倒入分液漏斗中并静置30 min。取出下相液，定容至250 mL，保存待测。

1.2.3.3 酸性水热烫两相法提取萝卜红色素

准确称取25 g萝卜片，立即置于50 mL煮沸的1%柠檬酸水溶液中热烫10 min，冷却后，将萝卜片进行榨汁处理，然后分别把热烫汁液、榨汁液和残渣进行收集。将残渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入1%柠檬酸水溶液，使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH调pH至2.5，在45 ℃条件下搅拌浸提2 h，使用抽滤装置进行抽滤，收集浸提液，最后将热烫汁液、榨汁液与浸提液混合，以之前所加入的1%柠檬酸水溶液1∶1的比例加入正己烷溶液，将混合物在45 ℃下搅拌并萃取1 h，倒入分液漏斗中并静置30 min。取出下相液，定容至250 mL，保存待测。

1.2.4 萝卜红色素的含量测定

萝卜红色素含量测定方法参考Lee等[11]的pH示差法，使用两种不同的缓存体系：0.25 mol/L氯化钾缓冲溶液（pH 1.0）和0.45 mol/L醋酸钠缓冲溶液（pH 4.5）。取1 mL色素提取液放入10 mL的具塞刻度试管中，再加入相应的缓存溶液稀释定容后，分别在最大吸收波长处测定吸光度（此次试验通过光谱扫描确定2种对应体系λman=510和700 nm处吸光度最大），萝卜红色素含量可按照式（1）计算：

式中：A为pH 1.0（A510-A700）-pH 4.5（A512-A700）；MW以天竺葵素-3-葡萄糖苷计算，相对分子质量为433.2；DF为稀释倍数，10；V为提取液最终体积，mL；1 000为单位换算比例，g换算为mg；ε为天竺葵素-3-葡萄糖苷消光系数，31 600 cm-1mg-1；m为原料的质量，g。

1.2.5 异硫氰酸酯的含量测定

异硫氰酸酯的含量采用吗啉滴定法[12]测定。

1.2.6 数据分析

上述的每次试验均设3个重复测定。测定所得数据制作成柱形图以及折线图进行分析，检验不同提取工艺的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同提取工艺下萝卜红色素含量分析

一些新兴的萝卜红色素提取方法，如超滤技术、酶工程技术、超临界流体萃取技术、高速分离等，虽具有耗时少、纯度和产量高等特点，但需要的技术和仪器成本过高，未能普遍应用，因此传统提取方法仍占据工业生产重要地位[13]。常用于提取萝卜红色素的溶剂有水、乙醇、甲醇、异丙醇和冰醋酸等，考虑到成本，工业上一般采用水提法[14]。由图1可知，热烫法提取的萝卜红色素含量最低，主要是因为高温条件下部分萝卜红色素分解损失。其次是鲜切法和两相法，而两相法仅在鲜切法的基础上加上了正己烷萃取的步骤，这说明正己烷的加入对萝卜红色素的提取量影响较小，这与萝卜红色素在正己烷溶剂中溶解度较低相符[15]。但是有研究表明，正己烷对于萝卜中硫代葡萄糖苷及其分解产生的一系列小分子含硫化合物均有较好的提取效果[16]。因此，作为食品工业中提取天然花青素着色剂较为安全且有潜力的有机溶剂，正己烷在萝卜红色素异味去除具有潜在的应用优势[17]。另外，酸提法提取的萝卜红色素含量最多，这主要是因为酸碱度能够显著影响萝卜红色素的颜色及稳定性，而色素在酸性条件下较稳定，在中性或碱性条件下易分解[4]。也有研究表明酸性条件可以加快细胞壁的破裂，从而增大色素提取率[7]。总体而言，从萝卜红色素提取效果而言应选提取效率高、省时、省钱和安全的酸提法。

图1 不同提取工艺对萝卜红色素提取含量的影响

2.2 酸提法单因素对提取萝卜红色素含量的影响

2.2.1 不同提取温度下萝卜红色素的含量

由图2可知，酸提法提取的萝卜红色素随着提取温度的升高，提取量增加，在45 ℃时提取量为1.48 mg/g，到达最高值，45 ℃后随着温度的升高而逐渐下降。这是因萝卜红色素属于天然花色苷类色素，在酸性条件下提取温度过高会使花色烊阳离子降低，且升温可促进传质，有利于提高萝卜红色素的提取，但高温会导致红色素的分解，同时也会导致提取量的减少[18-19]。因此选择提取温度45 ℃最佳。

图2 提取温度对萝卜红色素提取量的影响

2.2.2 不同提取时间萝卜红色素的含量

由图3可以看出，提取时间在0.5～2 h之间，萝卜红色素提取量随提取时间的增长而逐渐增大，但2 h后继续增加提取时间提取量变化不大，结果表明，在2 h之后增加提取时间对萝卜红色素的提取量没有明显变化，因而提取时间2 h最为适合。

2.2.3 不同的提取料液比萝卜红色素含量

就单提取率而言，提取料液比越大，越有利于提取色素，但料液配比过大，提取液中的色素含量太低，将增加生产成本，因此在工业性生产中需权衡利弊[20]。由图4可知，提取料液比在1∶5（g/mL）时萝卜红色素的提取量达到最大值（1.46 mg/g），在1∶5（g/mL）后随着料液比增加，萝卜红色素的提取量呈缓慢增加趋势，这说明在残渣与料液比例为1∶5（g/mL）后再增加料液比对萝卜红色素提取量影响不大，因此，结合经济成本考虑，选择1∶5（g/mL）提取料液比最佳。

图3 提取时间对萝卜红色素提取量的影响

图4 提取料液比对萝卜红色素提取量的影响

2.2.4 提取pH的确定

在酸性环境中，花青素基本以红色的黄锌盐形态存在，而在碱性环境中，基本以蓝色的醒式形态存在，当处于等电点时，颜色变到最浅，花青素结构介于黄锌盐形式和醒式形式结构之间[21]。从图5可以看出，萝卜红色素的提取量随着提取的pH增加而逐渐降低，强酸条件可以促进植物细胞壁的分解，且萝卜红分子结构在低pH下向醌式结构转变，而醌式结构在水中的溶解度最大，从而使色素的提取率增加[7]。当溶液pH为2.5时，提取的萝卜红色素含量达最大值，因此，选择提取pH 2.5最佳。

图5 pH对萝卜红色素提取量的影响

2.3 提取组合方法对萝卜红色素含量的影响

将图6与图1对比分析可以发现，酸性水热烫法的提取效果要显著高于热烫法，说明萝卜在热烫基础上，相对于去离子水提取，柠檬酸水溶液提取具有较好的提取效果；但是酸性水热烫法的提取效果略低于酸提法，这说明该组合提取方式因萝卜高温热烫导致部分色素分解损失。另外，酸性水两相法提取效果要高于两相法则再次说明酸性条件色素提取效果较好；酸性水两相法提取效果与酸提法基本一致，而酸性水两相法仅在酸提法的基础上加上了正己烷萃取的步骤，说明针对色素提取效果而言，正己烷的加入对萝卜红色素提取影响不大，这与前述结果一致。同理，酸性水热烫两相法的提取效果要低于酸提法也是因为高温热烫色素的损失导致。从图6可知，3种组合方法中酸性水两相法的提取效率最高，也是基于另外两种方法中高温对色素的破坏所致。因此，针对所有提取方法进行分析，从萝卜红色素的提取效果而言，酸提法和酸性两相法具有最好的提取效果。

图6 提取组合方法对萝卜红色素含量的影响

2.4 提取方式对异硫氰酸酯含量的影响

2.4.1 不同提取工艺对异硫氰酸酯含量的影响

由图7可知，鲜切法提取得到的萝卜红色素中异硫氰酸酯含量最高，因为鲜切红心萝卜时细胞结构遭到破坏，细胞不同部位含有的萝卜硫苷及黑芥子酶相互接触，使硫苷分解产生异味成分异硫氰酸酯，因此其含量最高。相对于鲜切法，酸提法中异硫氰酸酯含量有所降低，低pH下的异硫氰酸酯含量较低可能是由于低pH下黑芥子酶活性受到抑制，萝卜硫苷水解速率降低，而在pH接近中性的去离子水中，硫苷可以较快进行酶降解产生异硫氰酸酯[22]。另外，热烫法提取得到的萝卜红色素中异硫氰酸酯含量最低，说明热烫处理可以灭活黑芥子酶，从而减少萝卜中硫苷的酶解，降低异硫氰酸酯的生成，达到大幅度减小色素提取液的臭味的目的。由于常规高温处理往往加热不均匀，导致灭酶活不充分，基于微波在高水分物质里具有良好穿透性和快速加热性的特点，因此也有研究采用高功率微波炉加热法，使得灭活过程快速而彻底[7]。从图7还可以看出，两相法得到的异硫氰酸酯含量与热烫法差异较小，说明正己烷的加入可以溶解异硫氰酸酯等异味成分，从而降低萝卜红色素中的异味，这与Chen等[23]研究结果一致。萝卜红色素本身不溶于正己烷溶剂，因此其在两相中分配在下相水中，而已经酶解产生的异味成分则进入上相正己烷中，进而将萝卜红色素与异硫氰酸酯等异味成分分开，达到除味的效果。

2.4.2 提取组合方式对异硫氰酸酯含量的影响

热烫法、酸提法、两相法相对于鲜切法均具有较好的除味效果，因此这3种提取方法进行综合研究，旨在保证萝卜红色素较好提取率的同时，降低萝卜红色素中的异味成分，以优化提取工艺。从图8可以看出，酸性水热烫法、酸性水两相法和酸性水热烫两相法相比于单一提取方法，其异硫氰酸酯含量均有不同程度降低，其中酸性水热烫两相法含量最低，说明3种方法同时组合对于异味的去除效果较好。前期的热烫处理使黑芥子酶失活，甚至为减少萝卜红色素热降解损失而降低热烫时间导致酶灭火不足，因为下相柠檬酸溶液的酸性，还能使萝卜硫苷的酶解过程受到抑制[24]，而残留的异硫氰酸酯等异味成分则进入到正己烷层中，因此其除异味的效果最好。

图7 不同提取工艺对异硫氰酸酯含量的影响

图8 提取组合方式对异硫氰酸酯含量的影响

3 结论

研究表明，萝卜红色素提取工艺受提取的温度、时间、pH、试剂和料液比等因素的影响，单一提取方法无法同时满足萝卜红色素的提取效率及除异味的效果。针对单一提取方法的不足，通过提取方法的组合以期达到较好的效果。就萝卜红色素提取效果而言，酸提法和酸性水两相法具有最佳的提取效果；就除异味效果而言，提取方式的组合相对于单一提取方法均具有较好的除异味效果，其中酸性水热烫两相法得到的色素中异硫氰酸酯含量最低，说明其除味效果最好。综合分析不同提取工艺下萝卜红色素的提取效率及除异味效果，酸性水热烫两相法虽然因为热烫处理导致萝卜红色素含量有所降低，但具有最佳的除味效果，能够显著提升萝卜红色素的经济价值，因此择其为去异味萝卜红色素的最佳提取方法。提取条件：选用1%柠檬酸水溶液为提取试剂，热烫10 min，提取温度为45 ℃，提取时间为2 h，提取的料液比为1∶5（g/mL），提取pH为2.5，正己烷于45 ℃两相搅拌萃取1 h。该方法具有操作简单，耗时短，成本低，除味效果好，产量高，安全无毒，适用于大规模生产等优点。