房辰晨，孙敬蒙，卢美彤，张炜煜

1. 长春中医药大学药学院（长春 130117）；2. 吉林大学白求恩第一医院药学部（长春 130021）

红景天（Rhodiola rosea）是景天科多年生草本植物，主要分布于吉林、西藏、新疆及云南西北部等地，由于其生长在高原环境，因此具有较强的生命力及独特的药用价值[1]，作为传统藏药，其应用广泛且具有悠久的药用历史，常用于心血管疾病的治疗。红景天提取物的化学成分主要有红景天苷、黄酮、多糖等，具有扩张血管、降血压、降血脂、改善微循环、抗肿瘤等药理作用。红景天苷是红景天药材的主要活性成分，临床上主要用于治疗由心血瘀阻导致的冠心病和心绞痛等疾病[2-3]。但是，红景天苷在吸收过程中由于受到主动外排机制的影响，生物利用度低[4]、半衰期短[5]。类脂质体是具有类似细胞膜结构的双分子层囊泡，由胆固醇、非离子型表面活性剂通过化学结合形成的一种单层或多层的新型药物载体。具有良好的细胞亲和性、组织相容性及缓释性等特点，且不易泄漏。其结构与脂质体类似，但与脂质体相比，因其不含磷脂，在制备过程中不容易受环境影响氧化或水解[6]，所以更加稳定。因此，将红景天提取物制备成类脂质体，其膜材中的聚氧乙烯基在其表面形成了立体位阻屏障，使其不易被巨噬细胞所识别和摄取，延长红景天的体内作用时间，提高疗效。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红景天，吉林省仙草医药药材有限公司；红景天提取物标准品，中国食品药品检定研究院；Span 80，湖南华日制药有限公司；Span 40，上海山浦化工有限公司；胆固醇（分析纯），天津天泰精细化学品有限公司；甘露醇，安徽山河药用辅料股份有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯），美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

AR2140型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；LXJ-ⅡB型低速大容量多管离心机，上海安亭科学仪器厂；Agilent 1200高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SD-1000型喷雾干燥机，东京理化器械株式会社；NS1001L2K型高压均质机，意大利Niro Soavi公司；KQ2200超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；JEOL透射电子显微镜，日本电子株式会社；DSC3差示扫描量热仪，梅特勒-托利多仪器有限公司；NICOMP 380/ZLS激光粒度仪，美国PSS粒度仪公司。

1.3 方法

1.3.1 红景天提取物的制备

取适量红景天药材，加8倍量水，提取3次，每次1 h，合并滤液，加乙醇调节至醇体积分数70%，以10% NaOH溶液调节滤液pH 8，离心取上清液，浓缩得到0.5 g·mL-1红景天提取液。取一定量的提取液，以1 mL·min-1速度上样，上样量为1.5倍柱体积，吸附1 h，以2 mL·min-1的洗脱速度依次用4倍柱体积的水、4倍柱体积的5%乙醇及11倍柱体积的20%乙醇进行洗脱，最后收集20%乙醇的洗脱液，蒸干，即得。

1.3.2 红景天提取物类脂质体的制备

取处方量的Span 40、Span 80、胆固醇，加一定量的乙醇，超声使其溶解，于65 ℃旋转蒸发得到薄膜，加适量乙醇进行脱膜，得薄膜溶液，备用；取红景天提取物，加PBS溶液（pH 7.4）超声使其溶解，将薄膜溶液与其混合，超声10 min，于60 ℃水合25 min，制得红景天提取物类脂质体混悬液，通过高压均质机，加乳糖适量搅拌使其溶解，按进口温度120℃、进料速度180 mL/h、雾化压力110 kPa、通风量为0.65 m3/min，喷雾干燥制备红景天提取物类脂质体粉末。

1.3.3 红景天提取物类脂质体包封率的测定

1.3.3.1 标准品溶液的制备

取约4.16 mg红景天提取物对照品，精密称定，置2 mL量瓶中，加甲醇制成每毫升含2.08 mg的对照品溶液，即得。

1.3.3.2 色谱条件

以安捷伦Angilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱；以乙腈-水（10∶90，V/V）为流动相；检测波长为275 nm；流速为1 mL/min；柱温为30℃；进样量为10 μL。

1.3.3.3 包封率的测定与计算

取约0.5 g红景天提取物类脂质体粉末，精密称定，置10 mL量瓶中，加PBS溶液（pH 7.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，转移至相对分子质量8 000～14 000的透析袋中，密封，置含120 mL PBS溶液（pH 7.4）的广口瓶中，在（37±0.5）℃、转速75 r/min条件下振荡，于140 min精密量取外介质5 mL，蒸干，用甲醇溶解并稀释至2 mL，摇匀，用0.22 μm滤膜过滤，作为包封率测定的供试品溶液，按“1.3.3.2”项下色谱条件进样测定，计算包封率，包封率按式（1）计算。

式中：EE为包封率，%；C总为红景天提取物总质量浓度，mg·mL-1；C游离为未包封的红景天提取物质量浓度，mg·mL-1。

1.3.4 正交试验与验证试验

根据单因素试验结果，选择HLB值（A）、表面活性剂与胆固醇比值（摩尔比）（B）、药载比（C）、水合温度（D）为影响因素，以包封率为考察指标，采用L9(34)正交试验法优选红景天提取物类脂质体工艺处方，因素水平设计见表1，将优选出的最佳处方及制备工艺进行验证试验。

表1 因素水平表

1.3.5 红景天提取物类脂质体的表征

1.3.5.1 形态、粒径及Zeta电位的测定

取红景天提取物类脂质体混悬液，加适量双蒸水稀释，滴加在碳膜覆盖的铜网上，自然晾干，再滴加1%磷钨酸负染3 min，待晾干后置透射电镜下观察其形态。取红景天提取物类脂质体混悬液适量，加适量双蒸水稀释，用激光粒度测定仪测定其粒径及Zeta电位。

1.3.5.2 差示扫描量热分析（Differential scanning calorimetric，DSC）

分别取红景天提取物、胆固醇、甘露醇、物理混合物及红景天提取物类脂质体粉末，置于铝质坩埚中，测定条件为起始温度25 ℃，终点温度300 ℃，升温速度10 ℃/min，保护气体流量150 mL/min，感应器内N2流量50 mL/min。

2 结果与分析

2.1 正交试验及验证试验

由表2和表3可知，影响类脂质体制备工艺的因素主次顺序为A＞D＞C＞B；其中，HLB值和水合温度对类脂质体制备工艺有显著性影响（p＜0.05）。故确定最佳工艺为A2B3C2D2，即HLB值为6，表面活性剂与胆固醇的比值为1∶1，药物与载体比值为1∶1，水合温度为60 ℃，验证试验结果见表4，表明该工艺稳定可行。

2.2 红景天提取物类脂质体的表征

2.2.1 形态、粒径及 Zeta电位的测定

由图1可知，红景天提取物类脂质体在电镜下为大小均匀的球形微粒。粒径分布见图2，红景天提取物类脂质体的平均粒径为661.7 nm，多分散指数（PDI）为0.360，Zeta电位为-19 mV。

表2 试验设计及结果

表3 方差分析表

表4 验证试验结果（n=3）

图1 红景天提取物类脂质体的透射电镜图（×75 000）

图2 红景天提取物类脂质体粒径分布

2.2.2 差示扫描量热分析

差示扫描量热分析测定结果如图3所示，红景天提取物在121.25 ℃处有吸热峰，甘露醇的熔点峰为166.86 ℃，胆固醇的熔点峰为150.15 ℃，当由三者制备成类脂质体后，只出现一个熔点峰，为204.15 ℃，且峰值发生变化，证明了类脂质体的形成。

图3 胆固醇（A）、甘露醇（B）、红景天提取物（C）、物理混合物（D）、类脂质体（E）的DSC图谱

3 结论

前期研究过程发现，传统薄膜分散法制备的类脂质体难包封率较低，原因主要是该方法水合需要的时间较长，易出现水合不完全的情况。故对该方法进行了改良，先将形成的类脂质体薄膜溶于乙醇后，再加入含药的PBS溶液进行水合，这样可大大增加薄膜在PBS溶液中的分散性，从而利于药物的水合。此外，传统薄膜分散法较难控制类脂质体的粒径，因此采用改良的薄膜分散法制备红景天提取物类脂质体混悬液后，再通过高压均质机，可使类脂质体粒径减小且均匀。采用改良的薄膜分散法制备红景天提取物类脂质体，运用单因素考察法结合正交试验对红景天提取物类脂质体处方及工艺参数进行分析优化，得到的优化工艺简单，稳定可行，为难溶性食品的研究提供参考。