黄 赫，管仲莹，赵 磊

(辽宁中医药大学附属第二医院检验科，辽宁 沈阳 110034)

随着经济的快速发展，近年来人们的饮食发生了很大的变化，脂肪食品占日常饮食的很大一部分。 持续的高脂饮食会导致体内的脂质代谢紊乱，主要表现为高水平的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高胆固醇血症和低水平的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)[1]。 糖脂代谢紊乱与糖代谢紊乱和脂代谢紊乱相联系，可诱发肥胖、2型糖尿病(T2DM)、高血压、血脂异常、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化等。除此以外，脂蛋白水平将受到干扰或合并脂质代谢紊乱，同时HDL-C水平降低，总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和LDL-C水平升高。最后，过度脂肪堆积引起肥胖并导致高脂血症。高脂血症被归类为导致心血管疾病发生的主要危险因素之一。越来越多的证据表明，高脂血症是心血管疾病的主要原因，与冠心病、中风、高血压、肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化和阿尔茨海默病等疾病密切相关[2]。脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化的病变基础，而主动脉粥样硬化常无特异性症状。本研究采用去卵巢手术模拟绝经期，探讨绝经期对高脂血症大鼠主动脉脂代谢的可能影响，进而阐明绝经期高脂血症影响主动脉血管脂质代谢的精细分子机制。

1 材料与方法

1.1实验材料:30只健康雌性SD大鼠(200±20)g购买于辽宁长生生物技术股份有限公司，合格证号为SCXK(辽)2015-0001。RNA提取试剂RE-03012购自FOREGENE公司，ABclonal 2×快速荧光定量qRCR反应预混液(低Rox)RK21202购自ABclonal公司，反转录试剂盒RR047A购自宝生物工程(大连)有限公司，大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C ELISA 试剂盒(批号201912)购自上海酶联生物科技有限公司。德国Thermo公司Multiskan FC酶标仪，ABI7500实时定量PCR仪。

1.2方 法

1.2.1动物模型的建立:30只健康SD雌性大鼠适应性喂养7d后，随机分为空白组、模型1组、模型2组。模型2组大鼠去除双侧卵巢，术后腹腔注射青霉素3d以防感染，阴道分泌物图片确定未出现后造模：模型1组和模型2组大鼠每天给予高脂饲料(3%胆固醇，0.5%胆酸钠，0.2%丙基硫氧嘧啶，5%白糖，10%猪油)连续8周，造模第7天、14天分别给予维生素D3(50万IU/kg、30万IU/kg)灌胃，第7周给予异丙肾上腺素(ISO)5mg/kg多点皮下注射，连续1周[3]。

1.2.2标本采集:空白组、模型1组、模型2组每日1次灌服同等容积蒸馏水。各组给药8周后分离心脏主动脉，液氮速冻后保存在-80℃冰箱。

1.2.3试剂盒提取大鼠主动脉血管mRNA:取心脏主动脉组织20mg 加入500μL Buffer RL1，电动匀浆器将组织研磨均匀；将研磨均匀的匀浆液转移至 DNA-Cleaning Column中(DNA-Cleaning Column 放入收集管中)，12000 rpm离心 2min；移除 DNA-Cleaning Column， 保留收集管内上清液；向上述上清液中加入 1.6倍体积Buffer RL2(使用前请确认已按照说明加入无水乙醇)，轻柔混匀；将 700μL混合液转移至 RNA-only Column 中(纯化柱放入收集管中)，12000rpm离心 1min，弃掉收集管中的废液；将纯化柱放回收集管中，将剩余混合液全部加入纯化柱中，12000rpm，离心1min，弃掉收集管中的废液；向纯化柱中加入500μL Buffer RW1，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液；向纯化柱中加入700μL Buffer RW2(使用前请确认已按照说明加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，重复1次；将纯化柱放回收集管中，12000rpm空管离心2min，去掉离心柱中残余的Buffer RW2；将纯化柱转移至新的离心管中，向纯化柱的膜中央滴加50～200μL已于 65℃预热的RNase-Free ddH2O，室温放置2min。12,000rpm离心1min收集RNA溶液。为提高RNA产量，将离心得到的RNA溶液重新加至纯化柱中，重复步骤1次。

1.2.4反转录反应:反应1：5×gDNase Mix 2.0μL，Template(RNA)5μL,RNase-Free ddH2O 3μL,42℃ 2min，4℃ +∞；反转录反应2：反应液1 10μL，5*RO-Easy Mix 4μL，RNase-Free ddH2O 6μL，37℃ 15min,85℃ 5s,4℃ +∞。

1.2.5实时定量PCR反应:采用SYBR Green法测定不同组目的基因的相对表达量。实时定量PCR引物见表1。PCR反应体系：cDNA 0.4μL，上游引物(10M) 0.4μL，下游引物(10M)0.4μL，2×SYBR Green Fast qPCR Mix with Low Rox 10μL，ddH2O 8.8μL。PCR反应程序：95℃ 2min；95℃ 15s，60℃ 1min，72℃ 1min，40cycles；95℃ 15s,60℃ 1min,95℃ 15s,60℃ 15s。使用β-actin为内参基因，目标基因相对表达量RQ=2-△△CT(△CT=CT目标-CT内参，△△CT=△CT模型组-△CT对照组)，目标基因相对表达量以平均数±标准差表示。

表1 引物序列

1.2.6ELISA测定大鼠血清总胆固醇含量:标准品的加样：设置标准孔和样本孔，标准品孔加不同浓度的标准品50μL；加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同)、待测样品孔；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释剂40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)；加样将样品加于酶标孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外；温育：用封板膜封板后置37℃温育60min；配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，没空加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干；显色：每孔加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min；终止：每孔加入终止液50L，终止反应；测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。测定应在加终止液后15min以内进行。

1.3统计方法:采用SPSS15.0分析实验数据，结果以均数±标准差表示，统计学处理用单因素方差分析，以P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1大鼠血清血脂含量测定:①与空白组相比，模型1组和模型2组TC、TG、LDL-C含量明显增加升高(P<0.01)，HDL-C含量明显降低(P<0.01)，差异有统计学意义。②同模型1组比较，模型2组TC、TG、LDL-C含量显著升高(P<0.01)，HDL-C含量明显降低(P<0.01)，具有统计学意义。详见表2。

表2 去卵巢手术对大鼠血清血脂的影响

2.2大鼠主动脉ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA水平比较:①与空白组相比，模型1组和模型2组ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA相对表达量明显降低(P<0.01)，差异有统计学意义。②模型2组ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR 相对表达量显著低于模型1组(P<0.01)。详见表3。

表3 大鼠主动脉ABCA1 ApoA1 CAV1 SRB1 VLDLR LDLR mRNA表达水平测定

3 讨 论

高脂血症常伴有脂质代谢异常，如低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平升高，以及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低。高脂血症是心血管疾病的主要危险因素，而心血管疾病是全球死亡率的主要原因之一[4]。

动脉粥样硬化是一种与脂质和其他代谢改变相关的动脉炎症性疾病[5]。它也是心脏病和中风等心血管疾病的一个重要因素，世界各地的发病率和死亡率均增加[6]。动脉粥样硬化主要由脂质积累和免疫细胞过滤，以及分子相互作用引起，导致斑块的发生、破裂和血栓形成[7]。动脉粥样硬化分为很多种，其中主动脉粥样硬化大多数无明显临床症状。许多研究高脂血症大鼠疾病发生的分子机制集中在肝脏，而本研究从主动脉角度探索绝经期对高脂血症女性的影响的可能机制。

小窝蛋白的作用是介导脂蛋白分子的内吞和外吞以及脂质跨膜转运,小窝蛋白受体LDLR、SR-B1和ABCA1主要介导脂质的外流。研究表明小窝蛋白-1(Caveolin-1，Cav-1)与脂质代谢相关,低密度脂蛋白受体(LDLR)、极低密度脂蛋白受体(VLDLR)、ATP结合盒转运蛋白a1(ABCA1)以及B类清道夫受体(SRB1) 共同组成脂质跨膜转运系统[8]。 ApoA1为高密度脂蛋白的重要结构蛋白，高密度脂蛋白(HDL)、LDL、极低密度脂蛋白(VLDL)以及蛋白质胆固醇输送蛋白(CETP)共同组成细胞外脂质沉积系统。ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA水平的改变与脂质代谢密切相关。

LDL、TC和TG与高脂血症发生密切相关。高脂血症是脂质异常转运的直接结果，通过脂质转运蛋白及其受体在脂质转运中发挥关键作用。与空白组相比，模型1组和模型2组TC、TG、LDL-C含量明显增加(P<0.01)，HDL-C含量明显降低(P<0.01)，提示造模成功，模型2组TC、TG、LDL-C含量明显高于模型1组(P<0.01)，HDL-C含量明显低于模型1组(P<0.01)，提示去卵巢手术+高脂血症模型对大鼠脂质代谢的影响更大。实时定量PCR结果显示，模型1组和模型2组比空白组ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA表达量明显降低，可能是雌性高脂血症大鼠患病后脂质转运相关受体ABCA1等减少。模型2组与模型1组相比，ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA表达量降低更显著(P<0.01)，推测去卵巢手术后雌激素下降影响脂代谢，导致小窝蛋白(CAV1)、脂质转运受体(LDLR、VLDLR、SR-B1和 ABCA1) 、高密度脂蛋白结构蛋白(ApoA1)mRNA的相对表达量降低幅度更大，提示模型2组可能由于去卵巢手术后雌激素的改变使得脂质转运受阻更严重。

综上，ELISA实验结果提示造模成功，且去卵巢手术导致雌激素下降使得大鼠高脂血症更严重。实时定量PCR结果提示去卵巢手术对高脂血症大鼠主动脉的脂质跨膜转运和脂质沉积等影响更大，推测绝经期可能对高脂血症女性主动脉脂质代谢的影响。绝经期干预高脂血症女性的可能机制有待完善，本研究通过去卵巢手术模拟女性绝经期，从分子生物学水平揭示去卵巢手术可影响雌性高脂血症大鼠主动脉脂代谢相关受体和脂蛋白结构蛋白的mRNA相对表达量和血清血脂含量，推测去卵巢+高脂血症组大鼠可能脂质代谢受阻更严重。为未来开展绝经期干预女性高脂血症发生与发展的完整分子机制研究奠定基础，为主动脉粥样硬化确诊的指标选定提供分子生物学依据。