梁莉 许亦权 杨楠 王辰

[關键词]牙周膜干细胞;内皮素-1;丝裂原激活蛋白激酶;Runx2;骨钙素;牙周炎

牙周炎导致牙槽骨出现损伤，所以骨再生是牙周病诊治的重中之重。牙周膜干细胞（Periodontal ligamentstem cells，PDLSCs）作为骨再生的不可忽视的一大细胞[1]。干细胞参与骨再生过程，并且受很多因子影响，内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）是多功能因子，在该疾病患者的牙槽骨吸收中起到了不可忽视的效用[2-3]。在之前实验中了解到ET-1经过丝裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs）信号通路促进PDLSCs的成骨分化，但具体机制尚不清楚[4]。因此，本实验旨在研究MAPKs信号通路在ET-1调控PDLSCs成骨分化过程中的作用机制，为牙周炎患者骨组织修复再生提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 主要试剂：内皮素-1（美国Abcam公司），α-MEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（FCS），胰蛋白酶（美国Gibco公司），Trizol（Invitrogen公司），Real-time PCR试剂盒（Takara公司），Western blot检测试剂盒及NC膜为Amersham公司产品。

1.2 体外分离PDLSCs细胞：使用13岁由于正畸原因而拔除的前磨牙患者牙齿，在无菌条件下用PBS反复冲洗牙根表面，收集牙根表面有牙周膜覆盖部分的牙周韧带组织，剪碎后用胶原纤维酶消化处理为单细胞悬液。用含FBS的α-MEM培养基培养1周左右，胰酶消化细胞。以每孔0.1ml的浓度将细胞接种于96孔板，隔天换液，1周左右后将具有克隆形成的细胞挑选出，标记为原代细胞。原代细胞继续接种于培养瓶中，待细胞融合至70%时，按照1：3的比例传代，取3～4代细胞进行实验。使用流式细胞仪对已经得到的细胞进行干细胞表面分子标志物测定过程。

1.3 细胞处理：牙周膜干细胞依照1×105/孔的密度在6孔板中进行培养，等待生长12h后，观察其贴壁情况，使用α-MEM培养基对其培养。……