刘云孙增先

(连云港市第一人民医院药学部,江苏连云港 222061)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一种致命性心肺疾病,其病理特征是持续性肺血管收缩、血管重构、原位血栓形成和血管周炎性浸润等,导致血管腔狭窄或闭塞,引起肺血管阻力(pulmonary vascular resistance,PVR)和肺动脉压力(pulmonary artery pressure,PAP)进行性增加,最终导致右心衰竭和死亡[1-3]。按病因不同将PAH分为几个亚组,包括特发性、遗传性、药物和毒素诱导的PAH 及系统性硬化症等相关形式的PAH,无论其病因如何,所有形式的PAH 都表现出相似的肺血管病变,具有共同的病理机制[4]。最新流行病学数据显示特发性和遗传性PAH 发病率为每百万居民5 例,患病率为每百万居民25 例,并且逐年增加趋势明显[5]。PAH 发病机制非常复杂,涉及炎症、氧化应激和代谢转换等机制[1,6],尽管对PAH 及其发生机制研究取得了很大进展,但目前最先进的治疗方法仍然不能靶向正在进行的重构过程,而是通过调控涉及维持血管张力的信号通路来治疗PAH,5 年生存率只有 57%[7-9]。精确阐明 PAH 发病机制,寻找新的有效治疗策略一直是临床的迫切需求和研究热点,而动物模型是实现这一目标的基础[10]。然而,目前还没有一种PAH 动物模型能够复制PAH 的所有特征,包括血液动力学改变和组织学重构[11-12]。本文对PAH 动物模型进行回顾性总结,旨在为PAH 病理机制及防治研究提供理论基础和实验载体。

1 缺氧PAH 大鼠模型

在多种动物物种中,常采用常压和低压缺氧诱导PAH[13]。这个模型在选定的动物品系中具有非常好的可预测性和可重复性[13]。但物种间对慢性缺氧的反应存在差异,反应也受到年龄等因素的影响,年轻个体更容易受到这一诱因的影响。最常用的缺氧动物是大鼠和小鼠[12-13]。几乎所有研究过的哺乳动物中,缺氧诱导的PAH 有非常相似的结构改变[13]。肺泡壁中正常非肌化末梢小动脉迅速肌化,非肌化的小动脉壁中表达α-SMA 的细胞迅速增加[13]。除了周细胞的分化和/或平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMC)“迁移”外,局部成纤维细胞募集和分化、单核细胞/祖细胞募集、内皮细胞(endothelial cell, EC)向间充质样细胞的转分化也可以解释这些变化[13]。中膜SMC 显著增殖、肥大,前毛细血管肺动脉增厚[13]。炎症在缺氧诱导的重构过程中起着重要作用,缺氧诱导早期和持续期肺动脉特异性血管炎症反应,某些趋化因子/趋化因子受体早于炎性细胞出现,此过程的炎性细胞主要为单核细胞。血管壁内粘附分子和细胞因子持续存在,并伴有持续的炎症浸润[13]。此外,大的近端肺动脉显著增厚和纤维化,这些血管明显硬化[13]。在缺氧2 周后,大鼠发生中度PAH,平均PAH 增加一倍,这似乎与结构改变的进展有关[13]。右心室肥大,但没有右心衰竭的证据[13]。大鼠和小鼠对缺氧反应存在明确的差异,小鼠的缺氧反应有种系特异性[12-13]。恢复常氧环境可以逆转所有动物模型缺氧诱导的PAH[14-15]。在这些慢性缺氧模型中,没有类似于人类PAH 的不可逆的内膜纤维化或丛状病变发生[12-13]。缺氧肺结构改变的严重程度还受其他因素的影响,而不仅仅是缺氧。因此,啮齿动物中PAH 的慢性缺氧模型可以被认为是不太严重的PAH 模型,并被视为与缺氧相关的人类PAH 相关,如发生在肺实质疾病、睡眠呼吸紊乱、严重慢性阻塞性肺病和高海拔居住[13,16]。炎症、氧化应激、线粒体功能改变等参与了缺氧PAH 模型机制调控,涉及 Hif-1α、p38 MAPKα、NF-κB、Rho/Rho 等信号路径[15,17-18]。

2 野百合碱PAH 大鼠模型

野百合碱(monocrotaline,MCT)是一种吡咯里西啶生物碱,存在于植物紫花野百合中[13]。MCT必须在体内经肝脏细胞色素P450 3A4 代谢成毒性代谢物MCT 吡咯(monocrotaline pyrrole,MCTP),进而导致血管内皮细胞损伤和炎症反应[10,13]。不同物种和种系对MCT 反应不同,MCT 诱导PAH 的首选物种是大鼠,即使给予小鼠MCTP 也不能获得预期的结果[11,13,19]。MCTP 在血浆等水溶液中快速降解(半衰期为3 ～4 s),但它可以在红细胞中积累和转运,保留了与肺组织相互作用的能力,这种作用导致内皮细胞损伤,并于数周后进展为PAH[11,20]。MCT 与其肺毒性存在关系[11],为了提高模型的成功率,通常采用60 mg/kg 单次腹腔内或皮下注射,3 ～ 4 周后发展为 PAH[11]。肺 EC 被认为是 MCTP的特异性靶点,MCTP 能与EC 膜发生特异性交联,直接导致EC 功能受损[21]。因此,EC 是最早发生病变的细胞。在MCT 给药后9 ～24 h EC 发生改变,病变以EC 肿胀、胞质囊化、胞浆不规则增厚、溶解为特征,并随时间推进而进展,最终扩展到肺血管的各级血管,其中毛细血管和小动脉更为严重[22]。毛细血管膜的通透性增加,此时出现血小板和纤维蛋白血栓栓塞,大量的小血管管腔被部分或完全阻塞[22]。中膜改变发生在内膜改变之后,其特征是平滑肌肥大、增生,平滑肌延伸至正常非肌化的末梢小动脉[22]。细胞外基质(胶原蛋白、弹力蛋白)含量增加,并与增殖的SMC 共定位[22]。外膜水肿和炎症细胞浸润,晚期见成纤维细胞增殖、胶原沉积、出血等[22]。在血管重构过程中伴随SMC 迁移、新内膜形成、SMC 肥大和结缔组织过度形成[22]。小动脉重构发生在中、大动脉之前,且小动脉中膜增厚程度要大于大动脉[22]。此过程伴随着PVR 和PAP 持续增加,其严重程度随时间推移和MCT 剂量增加而进展。炎症、氧化应激、代谢重编程等参与了MCT PAH 模型机制调控,涉及p38 MAPKα、NF-κB、PI3K/Akt/mTOR、NO 等信号路径[11,15,23]。

MCT 诱导的PAH 大鼠模型能够模拟人类PAH的几个关键方面,包括血管重构、内皮功能障碍、SMC 增殖、炎性细胞浸润和右心室衰竭[11]。该模型只需要单次药物注射,且成本低廉,易于重复。其不足之处是不能模拟严重PAH 病理学的关键特征——新内膜和丛状病变[12-13],以及随时间推移而PAH 可逆(4 周后),易用药物预防或治愈[15,19]。目前临床正在使用的三类药物(内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂、前列环素类似物)均是通过该模型进行评估[11]。

3 基因工程PAH 动物模型

随着生物技术的进展,出现各类基因工程PAH小鼠模型,如Egln1 敲除小鼠模型[12,24]、IL-6 过表达小鼠模型[12-13]、S100A4/Mts1 过表达小鼠模型[13]、BMPR2 突变小鼠模型[13-14]、5-HT 转运体过表达小鼠模型[14]等,以及这些基因工程小鼠模型与慢性缺氧的双击试验[12,14]。这些基因工程小鼠模型为PAH 特定基因途径的机制研究和验证提供了证据支持,但其整体PAH 表型与人类PAH 疾病表型还有很大差距,还不能作为 PAH 疾病研究的替代模型。

4 PAH 双击大鼠模型

经典 PAH 动物模型(缺氧诱导 PAH 模型和MCT 诱导PAH 模型)为PAH 病理基础研究和当前临床治疗做出了卓越的贡献,尤其是MCT 诱导PAH 大鼠模型。随着PAH 病理机制认识的深入,发现经典动物模型不能重现人类严重疾病的关键病理特征[12-13]。目前,普遍认为PAH 的发病机制存在两个关键阶段,第一阶段为肺动脉非特异性中膜和外膜增厚,平滑肌向正常非肌化的小肺动脉末梢延伸,以及异常的炎症细胞反应;第二阶段为进行性重构过程,导致中小肺动脉新内膜形成、丛状动脉病变和血管闭塞性病变,血液流动受限。这两个阶段中的每一个阶段均可导致严重的PAH、右心室肥大、失代偿性右心衰竭和死亡。PAH 经典模型的第一阶段特征很明显,然而,缺氧诱导的PAH 在这个阶段趋于停止,并且没有进展到第二阶段,即肺动脉的非特异性、小动脉明显肌化,但是不会出现复杂的重构过程。此外,延长缺氧引起单核细胞和树突状炎症细胞浸润,但不会引起人类疾病中观察到的 T 细胞浸润。相反,MCT 诱导的 PAH 模型引起的肺血管重构似乎要比缺氧诱导的PAH 模型严重些,但它仍然不能真正形成类似于在人类观察到的严重丛状动脉病变[12-13,25]。MCT 模型诱导肺动脉末梢肌化,除了复杂的炎症反应外,可能归因于其广泛的肺毒性。由此可见,经典模型似乎只是引起PAH 的第一阶段,而不是第二阶段[12-13]。因此,对经典动物模型进行修改已成为PAH 研究的一项重要工作,已开发了多种“双击”动物模型,如MCT/缺氧大鼠模型、 MCT/肺切除大鼠模型、SU5416/缺氧大鼠模型,以及基因操纵/缺氧小鼠模型等等,以解决PAH 病理机制第二阶段的关键病理特征,使之更接近于人类PAH 的病理过程。

4.1 MCT/缺氧大鼠模型

将两个经典模型(慢性缺氧模型和MCT 模型)组合即为MCT/缺氧大鼠模型,采用60 mg/kg 野百合碱单次注射加4 周慢性缺氧暴露诱导,可以产生严重PAH 大鼠模型。该模型显示血流动力学和肺动脉组织结构的严重改变,类似于在人类严重PAH中所观察,特别是中膜严重肥大、新内膜增厚、内皮异常增殖到的病理特征、丛状病变和血管腔闭塞与纤维蛋白血栓、血管周炎性浸润。这些结构性改变导致PVR 和PAP 显著增加,引起更严重的右心室肥大和右心室收缩压增加[16,26-27]。

4.2 MCT/肺切除术大鼠模型

MCT 另一个双击模型就是MCT/肺切除术大鼠模型,该模型是对大鼠实施左肺切除手术一周后,单次腹腔内或皮下注射MCT 60 mg/kg,4 周后,引起严重PAH 和进行性右心衰竭。这个模型重现了人类PAH 病理学的许多关键特征,如中、小肺血管闭塞性新内膜形成、中膜肥大增厚、复杂丛状病变、血管闭塞、血管周炎性增生等表型,最终导致严重PAH,右心室肥大、功能严重受损[13,28-29]。左肺切除导致肺血流量增加和紊乱,剪切应力的剧烈改变触发严重的肺血管重构,导致新内膜形成和复杂丛状病变,PAH 进行性恶化[13,28]。在 MCT/肺切除术早期(3 周),显示非特异性组织学改变,如中膜肥大、外膜增厚和小动脉的肌化,但这些变化可能是可逆的。后期(6 ～8 周),产生新内膜和丛状血管病变[28]。该模型需要特殊的手术技巧,使用受到一定的限制。

4.3 SU5416/缺氧大鼠模型

Taraseviciene-Stewart 于2001 年推出一种简练的SU5416/慢性缺氧大鼠模型,将慢性缺氧暴露与血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)酪氨酸激酶抑制剂SU5416联合应用,即单次注射20 mg/kg SU5416 后慢性缺氧暴露3 周,导致新内膜改变的严重血管增生性PAH,与人类 PAH 丛状动脉病变类似[13,30-32]。表现为血管EC、SMC 过度增殖导致前毛细血管动脉管腔闭合、内皮丛状病变形成,肺血管重构进行性加重,进而导致右心衰竭,即使恢复常氧也不可逆[13,31,32]。而SU5416/常氧暴露大鼠仅引起轻度的PAH 和肺血管重构[13]。该模型导致严重PAH 的机制可能有以下几个方面:一是存活信号丧失致使EC大量凋亡,导致凋亡抗性且表型改变的EC 出现,这些EC 的过度增殖产生类似人类PAH 的丛状动脉病变[12,31-33]。二是通过VEGFR 非依赖性途径上调并激活芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR),导致雌激素代谢产物增加,促进肺动脉EC和SMC 增殖[33]。此外,AhR 通路和缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,Hif)信号传导存在串扰,SU5416 增强 AhR 核转位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT)表达,ARNT(也称为Hif1β)参与缺氧信号传导,进而增强慢性缺氧的促增殖作用[33]。

SU5416/慢性缺氧仅影响肺血管系统,而不影响其他器官的脉管系统[31-32]。SU5416 半衰期仅为30 min,在体内被快速清除,在主要器官及肺中没有积累。但SU5416 却具有长效抑制活性,这是由于SU5416 与EC 膜具有特异的亲合力,优先在EC 膜浓缩富集,然后再将SU5416 缓慢释放进入细胞质,并长时间保持 SU5416 对 VEGFR 的抑制作用[31]。内皮细胞生存信号丧失、氧化应激等参与了SU5416/缺氧 PAH 模型机制调控,涉及 VEGFR、TGF-β/BMP/Smad、 Hif-1α、 MAPK、 AhR 等 信 号路径[30,32-33]。

在SU5416/缺氧大鼠模型基础上发展的SU5416/缺氧/常氧大鼠模型,即单次注射20 mg/kg SU5416 和 3 周慢性缺氧后,恢复常氧 10 ～ 11周[12,28,31]。该模型除了由SU5416/缺氧驱动的严重PAH 表型外,复氧10 周导致严重丛状动脉病变形成,不仅重现了人类PAH 疾病中所见的第一阶段,而且重现了第二阶段。在这个大鼠模型中,三种类型的丛状动脉病变都被重建,即同心层状新内膜、茎样和动脉瘤样复杂病变,这三种类型的复杂病变与人类晚期PAH 发展的严重丛状动脉病变极为相似,同时PAH 和右心室肥大显著增加[12]。这种大鼠模型成为PAH 动物模型开发的标杆之作。

4.4 其他PAH 双击模型

其他PAH 双击模型,如MCT/主动脉分流大鼠模型[34]、左肺切除/SU5416 大鼠模型[28]、SU5416/缺氧小鼠模型[30,32,35]、IL-6Tg+/缺氧小鼠模型[12]以及其他基因操纵/缺氧小鼠模型等,成模效果不如上面介绍的双击模型,实践中应用不多,不代表PAH 研究的主流实验动物模型。

5 结语

PAH 是一种多病因、进行性、机制复杂的人类疾病,血管重构是其关键病理特征,开发能够重现人类PAH 所有特征的动物模型将为PAH 病理生理机制研究和新的防治策略评价提供重要支撑。目前已开发的PAH 动物模型均有一定的局限性,如经典PAH 动物模型(缺氧模型和MCT 模型)不能再现人类疾病的严重病理学特征(新内膜和丛状病变),而双击模型可以概括人类 PAH 更多的病理特征——进行性、不可逆的肺血管重构,重述严重的PAH 病理特征。SU5416/缺氧模型可重现 PAH 晚期复杂的丛状病变,但不能重现血栓性病变。其他双击模型只重现PAH 早期的丛状病变,MCT 双击模型还可呈现血栓性病变和炎症病变。因此,开发简便易行,能够重现人类PAH 病理生理特征的动物模型仍是努力方向。在实际应用中,应当根据研究目的选择最合适的动物模型,推荐使用一种以上的PAH 动物模型。