张 芮司 维*

(1.昆明理工大学灵长类转化医学研究院,昆明 650500;2.省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室,昆明 650500)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗引起的以高血糖为特征的一组慢性代谢疾病,主要分为1 型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)、 2 型 糖 尿 病 (Type 2 diabetes mellitus, T2DM)、妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)和单基因糖尿病[1]。 根据国际糖尿病联盟(http:/ /www.diabetesatlas.org/)的统计,截至2019 年全球糖尿病患者超4.63 亿,预计2045 年将增至7 亿。 中国已成为糖尿病第一大国,患者超过1.16 亿。 其中,T1DM 是一种由T 淋巴细胞介导的自身免疫性疾病。 由于胰岛β 细胞受损而导致胰岛素分泌不足[1],T1DM 患者需要完全依赖外源胰岛素治疗。 虽然胰岛素治疗已从过去的“每日餐前一针”发展到“人工智能控制的胰岛泵”[2],但并不能根治,也不能防止包括视网膜病变、神经病变等一系列并发症的发生[3]。 近年来,胰岛移植结合免疫抑制已成功应用于T1DM 的治疗[4],但由于供体器官严重缺乏、需要终身免疫抑制以及胰岛移植后难以长期存活等问题限制了临床应用[5]。 因此,干细胞替代疗法有望成为治疗T1DM 的医学发展新途径[6],就应用干细胞诱导分化产生功能性胰岛β 细胞或胰岛类器官替代治疗T1DM 的研究进展作一综述,为干细胞治疗T1DM的临床转化提供参考和借鉴。

1 体外诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞

胰岛β 细胞的再生和替代治疗被认为是治愈T1DM 的有效途径,目前研究多为基于动物模型的临床前研究,主要以人胚胎干细胞(human embryo stem cells,hESCs)、人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)和成体干细胞(adult stem cells,ASCs)等为种子细胞定向诱导分化,并通过细胞移植修复或替代受损胰腺组织[7]。

1.1 胚胎干细胞的替代疗法

自2001 年首次发现hESCs 能在体外自发分化为产胰岛素的细胞以来[8],许多分化方案被陆续报道,产生了多激素细胞的混合群体,但整体分化效率低下且胰岛素含量低。 2006 年 D’Amour 等[9]模拟胰腺发育,使用五步诱导法分化出含有7%胰岛素阳性细胞的内分泌细胞团,但缺乏对葡萄糖刺激产生反应的功能。 Kroon 等[10]诱导hESCs 定向分化为胰腺祖细胞,移植到免疫缺陷小鼠体内进一步成熟为功能性的胰岛β 样细胞,并可以维持3 个月的体内葡萄糖稳态。 2014 年Rezania 等[11]取得重大突破,采用七步诱导法从hESCs 中分化出表达胰岛β 细胞关键标志物包括MAFA和INS等的胰岛β 样细胞,移植后2~6 周就能成功逆转DM 小鼠血糖。此外,Pagliuca 等[12]开发了悬浮培养系统能大规模生产 hESCs 衍生的胰岛 β 细胞(SC-β 细胞)。 鉴别分化过程中形成的细胞类型对提高β 细胞的分化比例尤为重要,最近一项研究利用单细胞RNA 测序技术对hESCs 诱导分化产生的细胞类型进行了分析,鉴定出了胰岛β 细胞、α 样多激素细胞、非内分泌细胞和未曾报道过的肠嗜铬细胞,而且用携带CD49a 抗体的微珠磁性分选成功富集到80%以上的SC-β 细胞[13-14],为进一步的临床转化应用奠定了基础。

目前,所有hESCs 诱导分化胰岛β 细胞的方案都依赖于对生长因子以及分子信号通路激活或抑制的调控,例如最近提出的优化方案:抑制YAP 促进胰岛β 细胞生成,改善胰岛素分泌功能[15];抑制WNT 通路提高分化效率,增加内分泌细胞的比例[16]等。 尽管利用 hESCs 分化生产胰岛 β 细胞已经取得了显著进展,但仍存在如hESCs 的伦理限制以及异体细胞排斥反应等障碍,而且不同的hESCs细胞系分化能力也存在差异,限制了其临床应用[17]。

1.2 诱导多能干细胞的替代疗法

利用患者自体细胞通过重编程获得hiPSCs,定向诱导分化获得遗传背景一致的胰岛β 细胞,在治疗 T1DM 方面有巨大潜力[18]。 2008 年 Tateishi等[19]首先证明了皮肤成纤维细胞来源的hiPSCs 能够通过模拟胰腺发育在体外产生胰岛样簇,随后Zhang 等[20]诱导分化的胰岛素生成细胞能检测到PDX1 的表达和C 肽的合成。 针对hESCs 开发的胰岛β 细胞分化方案已成功应用于hiPSCs[11]。 值得注意的是,胰腺祖细胞中PDX1 和NKX6.1 的共表达对于有效生成功能性胰岛β 细胞是必不可少的,Russ 等[21]去除了常用的BMP 抑制剂,使用维甲酸联合EGF/KGF,有效地诱导出PDX1+/NKX6.1+胰腺祖细胞群,产生对葡萄糖刺激有反应的胰岛β 样细胞,降低 DM 小鼠血糖,在短期移植后仍保持功能。

hiPSCs 来源的胰岛β 细胞结合基因编辑技术是细胞疗法的一个主要方向。 Maxwell 等[22]利用Wolfram 综合征患者的hiPSCs 诱导分化为胰岛β 细胞,使用CRISPR-Cas9 技术纠正细胞WFS1 基因的突变后移植到 DM 小鼠体内逆转了血糖,这是CRISPR 首次被用于修复DM 患者的遗传缺陷,开启了基因编辑结合细胞治疗DM 的新篇章。 CRISPR基因诱导系统(CRISPR-on)是一种新型的RNA 引导的转录激活系统,Giménez 等[23]用融合了转录激活因子(dCas9-VP160)的 CRISPR-ON 系统转染T1DM 患者的成纤维细胞,激活胰岛β 细胞发育基因如内源性人胰岛素基因(INS),增强了胰岛素分泌。 但目前患者来源的hiPSCs 分化效率较低[24],还存在肿瘤转化风险、基因组不稳定及成本高等诸多不利因素。

1.3 成体干细胞的替代疗法

ASCs 是存在于成年后各组织器官中具有自我更新能力和分化潜能的细胞。 可从T1DM 患者中分离出成体干细胞,在体外定向诱导分化为胰岛β 细胞,再移植回患者体内达到长期治疗的目的。 具有强大免疫调节特性、多向分化潜能、自我更新能力的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)在临床试验中得到了广泛的应用[25]。 MSCs 调控促炎症作用的效应T 细胞,抑制自身免疫反应,单独或与胰岛β 细胞联合移植可有效逆转T1DM 患者的高血糖状况[26],使T1DM 患者体内剩余的胰岛β 细胞功能得以部分恢复或延迟细胞损伤[27]。 近年来,许多研究团队把不同来源的人MSC 诱导分化为胰岛β 细胞,在DM 小鼠体内可分泌胰岛素,表现出与人胰岛β 细胞相似的Ca2+变化和L 型Ca2+通道活性[28]。 另一方面,将胰腺关键转录因子如PDX-1等基于病毒介导转染MSC 也能获得具有胰岛β 细胞功能的细胞[29]。

脂肪组织来源的间充质干细胞(adipose tissuederived MSCs,ADMSCs)因其来源丰富且易于分离成为目前研究的焦点之一。 使用 ADMSCs 治疗T1DM 的方法大致可以分为以下四类:(1)ADMSCs诱导分化胰岛素分泌细胞(Insulin-producing cells,IPCs) 用于移植治疗 T1DM[30],在分化过程中ADMSCs 的免疫调节特性能得到维持[31],与未分化的ADMSCs 相比,IPCs 可以耐受移植物排斥反应。(2)单独移植ADMSCs 治疗T1DM 能改善胰岛功能,增加血清胰岛素水平[32],其治疗有效性在T1DM 动物模型中已得到认可,但单独使用ADMSCs治疗还局限于T1DM 患者发病早期[33]。 (3)许多研究小组阐明使用ADMSCs 联合胰岛移植的有效性和多功能性,发现ADMSCs 联合移植治疗可以逆转T1DM 小鼠血糖,明显抑制炎症细胞浸润,促进移植物血管生成,延长存活时间[34]。 (4)ADMSCs 还被用于培养胰岛,在移植前将ADMSCs 与胰岛共培养有助于提高胰岛的生存能力,增加胰岛素释放,能显著改善DM 小鼠的高血糖症状[35]。

此外,Wang 等[36]对成年小鼠胰岛进行单细胞RNA 测序,发现了特异表达蛋白C 受体 (Procr)的胰岛成体干细胞,在体内正常生理状态下可分化形成四种类型的内分泌细胞,进一步培养可形成稳定的胰岛类器官,该研究回答了长期以来成体胰岛是否存在干细胞这一争议性问题,是干细胞基础研究的重大突破。 未来,胰岛成体干细胞将有望应用于T1DM 的治疗。

ASCs 获取相对容易,不存在伦理问题,同种异体免疫排斥反应与致瘤风险低,目前研究多集中在测试其恢复免疫稳态以及再生胰岛β 细胞的潜力。

2 干细胞衍生的胰岛类器官

天然胰岛是由 α,β,δ,ε 和 PP 细胞形成的异质结构,这种3D 构象产生的细胞间相互作用在调节激素分泌方面发挥着重要作用[37]。 胰岛类器官(pancreatic organoids,POs)是由原代胰腺组织或干细胞形成的与体内胰岛功能和组织类似的三维结构,是研究生理及病理条件下胰岛细胞的增殖分化及其与微环境的相互作用的理想方法。 大量研究表明,干细胞可以产生功能性POs,当植入不同的临床前DM 动物模型时,能够恢复至正常血糖。 2016年Kim 等[38]从 hESCs 衍生的hPOs 在体内和体外均显示出葡萄糖反应;随后,Wang 等[39]基于仿生3D 支架生成的hPOs 表达高水平的胰岛β 细胞标志物如PDX-1、Ngn3、Insulin等,更重要的是,这些hPOs 类似于成人胰岛,含有多种胰腺内分泌细胞,对葡萄糖刺激更敏感,高糖条件下胰岛素的分泌急剧增加,这是胰岛β 细胞成熟的标志之一。 此外,一个重大突破是hPOs 植入DM 小鼠体内后,3 d内迅速恢复血糖;相比之下,在之前的研究中,仅移植干细胞诱导分化的胰岛β 细胞至少需要超过40 天才能使DM 小鼠的血糖水平恢复正常[10-12,21]。 研究表明,干细胞衍生的hPOs 在细胞组成和胰岛微结构等方面都更接近天然胰岛[40]。

hPOs 移植体内后面临着氧合和宿主免疫反应的激活导致hPOs 功能逐渐丧失的难题。 近年来的研究通过生物材料包封提供免疫分离生物相容性,优化营养扩散和胰岛素释放,使植入的hPOs 实现长期生存并发挥功能[41]。 海藻酸盐微胶囊能提供更好的细胞氧合促进hESCs 分化聚集为hPOs[40]。Vegas 等[42]使用经三唑硫代喹啉二氧化物(TMTD)修饰的藻酸盐包封SC-β 细胞,在没有任何免疫抑制的情况下可为T1DM 小鼠提供长达174 d 的血糖校正。 TMTD 藻酸盐在非人灵长类动物中也开展了实验,显著地降低异物反应[43]。 最近,海藻酸钠与免疫调节趋化因子CXCL12 共包被SC-β 细胞,移植到T1DM 小鼠中促进了胰岛素分泌并实现长期的免疫保护,有效地延长 SC-β 细胞的生存时间和功能[44]。 这些发现为进一步开展T1DM 大动物模型治疗的临床前研究和临床转化奠定了基础。

另外,为了移植物能长期存活,可以通过形成新的血管获得宿主的营养和物质支持。 Wang 等[36]建立了Procr+胰岛干细胞与血管细胞共培养的3 D体系,成功获得与小鼠胰岛功能、形态、超微结构及转录组都相似的POs,在体外培养能传20 代以上,移植到DM 小鼠体内能够恢复血糖水平。 内皮化也是解决hPOs 移植后血供问题的一种方法。 通过与内皮祖细胞共培养移植可增强支架血管的形成,研究发现干扰间充质调节因子(PDGF)受体或纤维连接蛋白,可以使MSCs 向具有内皮潜能的中胚层前体细胞转化,在体内有效诱导新生血管形成[45]。 目前,纳米技术通过使用不同的聚合物和天然ECM 作为封装平台有巨大潜力,Skrzypek 等[46]开发的聚醚砜/聚乙烯吡咯烷酮(PES/PVP)平板多孔膜,无需添加水凝胶即可创建早期微血管网络[47],有望提高hPOs 存活时间。

3 展望

利用干细胞分化胰岛β 细胞移植治疗T1DM,能有效解决器官供体胰岛短缺的问题。 然而,目前还没有一种分化方案能够生成功能完备的胰岛β细胞以自我调节葡萄糖代谢,因此需要在细胞功能、移植后的存活率、遗传稳定性和生产成本等方面进一步优化研究。 另外,干细胞移植治疗T1DM向临床过渡要面临的挑战,还包括如何保护移植物免受异种排斥,避免自身免疫的反复发生,寻找能最大程度减少细胞损失的移植方式和部位等,这些问题的解决将有效促进干细胞来源的胰岛β 细胞替代治疗的发展。