赵佳琳，王学晶，曹 希，孙 强

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1超声医学科 2乳腺外科，北京100730

根据全球癌症(GLOBOCAN)统计报告，在全球范围内，乳腺癌约占所有女性恶性肿瘤的24.2%；仅2018年，乳腺癌在全球新发病例数约为209万，其中约62万患者死于乳腺癌[1]。在中国女性中，乳腺癌是发病率最高的癌症，在癌症相关死亡中排名第六，若按这样的趋势发展，预计到2021年，乳腺癌总发病例数将达250万[2]。目前以乳腺癌的临床病理分期及分子分型为基础制定辅助治疗策略已得到广泛应用，三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体均为阴性的乳腺癌，占所有乳腺癌的10%～17%，以发病年龄轻、分期晚、内脏转移风险大、组织学分级高及组织病理学淋巴细胞浸润密度高为特征，与其他亚型的乳腺癌相比预后较差[3]。TNBC预后差的原因主要是复发转移比例高，且复发后病情进展快，由于缺乏明确的治疗靶点，TNBC患者的治疗选择受限，因此研究TNBC的治疗意义重大[4]。现有研究表明，乳腺癌的预后不仅受肿瘤细胞的生物学特性影响，肿瘤间质状态也与之密切相关[5]。关于乳腺癌中肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)，相关研究最早可追溯至数十年前，虽然乳腺癌最初被归为非免疫原性肿瘤，但部分亚型的乳腺癌表现出高TILs水平。TNBC的特点是肿瘤免疫浸润比例高，且TILs可能预测更好的化疗反应和生存结果[6]。随着对TNBC免疫治疗的探索，相关药物也逐渐从前期试验走向临床实践。本文主要对TILs进行总结，并对其在TNBC免疫治疗中的进展进行阐述。

TILs相关概述

正常情况下，人体的免疫系统和免疫细胞维持在相对平衡的状态，该平衡状态一旦被打破，不仅可能引起一些感染性疾病，也可能导致肿瘤发生，并影响患者的预后和治疗效果。TILs是指存在于肿瘤癌巢内及间质中的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体，是机体应对肿瘤、诱发免疫反应的一种形式，位于肿瘤组织周围，能杀伤肿瘤细胞、减少肿瘤的转移[7]。

TILs的生物学特性早在20世纪40年代，研究者们已经发现乳腺髓样癌的主要特点为大量的间质淋巴细胞浸润，即使肿瘤组织学分级高或伴有腋窝淋巴结转移，乳腺髓样癌在系统治疗后仍可有良好的预后[8]。多年研究表明，乳腺肿瘤浸润免疫细胞由不同的细胞亚群构成，包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞及肥大细胞，这些免疫细胞亚群与乳腺肿瘤的特异及非特异性免疫相关[9]。Gu-Trantien等[10]对乳腺肿瘤浸润免疫细胞进行详细分类，其中T淋巴细胞约占75%，B淋巴细胞比例不到20%，单核细胞比例约为10%，而NK细胞及NK/T细胞则不足5%；TILs又可分为间质肿瘤浸润淋巴细胞(stromal TILs，sTILs)和上皮内肿瘤浸润淋巴细胞(intra-epithelial or intra-tumoral TILs，iTILs)，前者位于肿瘤间质而不与浸润性癌细胞直接接触，后者则为上皮内或瘤内浸润细胞，与癌细胞直接接触。

TILs的检测方法目前最常使用基于免疫组织化学或免疫荧光的方法来检测肿瘤组织中的TILs[11]，该方法使用石蜡包埋的肿瘤标本做染色，并可用于研究回顾性分析的档案标本[12]，其优点在于可利用大型临床试验所获得的患者资料进行预后分析。单克隆抗体可用于检测不同细胞亚群，如CD3+、CD4+、CD8+及FOXP3+淋巴细胞亚群[13]。近年来，组织芯片或组织微阵列技术(tissue microarray，TMA)及多重荧光免疫组织化学(multiplex immunohistochemistry，mIHC)也被用于TILs检测，其中后者通过在同一切片上产生多个彩色信号，可实现不同TILs亚群与肿瘤细胞共定位[14]。此外还可通过检测TILs相关基因表达产物来分析乳腺癌预后，如Schmidt等[15]研究证实，由肿瘤浸润效应B淋巴细胞表达的免疫球蛋白κC可能与乳腺癌预后相关。

由病理学家、肿瘤学家和免疫学家组成的国际免疫生物标志物协作组(International Immuno-Oncology Biomarker Working Group)一直致力于制定TILs检测的统一标准，并于2014年发表了首部关于TILs检测的国际指南[16]。在乳腺癌中，iTILs 的绝对数量较少、存在的区域范围小、分布的异质性明显，且不易通过HE染色法观察；而sTILs数量相对较多，易于观察评价，且癌巢密度、形态等变化对sTILs 影响较小，因此目前协作组推荐以sTILs作为试验研究和临床应用的主要指标。此外，协作组近期研究证实了TILs检测的可重复性，并努力减少因检测者的观察差异所带来的不一致性，这些研究奠定了TILs成为乳腺癌生物标志物的基础[17]。

上述检测方法从技术方面并不复杂，基本上可在所有病理实验室进行，但相较于目前常使用的其他乳腺癌生物标志物(如激素受体等)，TILs的检测要求较高，且强烈依赖病理学家的专业知识。Nederlof等[18]比较了病理学家们对iTILs、sTILs及6种免疫细胞(CD3+、CD4+、CD8+、CD20+、CD68+、FOXP3+)的检测结果，发现其中sTILs检测一致性最高，且高浸润者检测一致性优于低浸润者，由此建议在使用现有方法评估免疫浸润时需格外谨慎，并强调必要时可在TILs检测外进行转录组及甲基化等标准化免疫特征分析。但显微镜下TILs计数和基于多组学评估的一致性、以及不同组学之间的相关性均存在很强的异质性，目前临床试验中仍以免疫组织化学检测方法为主，尚需制定统一的国际标准，以定量和定性的方式结合多种方法(如免疫细胞的结构化空间分布和细胞活动的转录组信息等)，并根据免疫浸润程度对肿瘤进行分类，从而更准确地阐明TILs在肿瘤进展中的作用。

TILs与TNBC的免疫治疗

TNBC的免疫治疗淋巴细胞优势型乳腺癌(lymphocyte predominant breast cancer，LPBC)指sTILs或iTILs浸润比例在50%或60%及以上(以不同临床研究中各自定义为准)。TNBC在所有乳腺癌分型中淋巴细胞浸润比例最高，这也从侧面支持了其潜在免疫原性。现有研究数据中TNBC中LPBC约占10%～20%，其中sTILs比例约为15%～25%，而iTILs比例则低于5%～10%。与其他分型乳腺癌相比，TNBC拥有更高的克隆异质性、基因组不稳定性及突变负荷量，理论上可能有助于刺激宿主对肿瘤细胞的免疫应答[19]。近年来，关于TNBC“分型而治”的理念逐渐被强调，Jiang等[20]通过全面分析465例原发性TNBC队列的临床病理、基因组学及转录组学数据，将TNBC分为腔内雄激素受体型、免疫调节型、基底样免疫抑制型及间充质样型4种亚型，并在每个亚型中鉴定出相应的治疗靶标或生物标志物，其中免疫调节型TNBC的特点为TILs比例高，适用免疫治疗且预后好。

TNBC因其生物学特性，除常规放化疗之外治疗选择有限，出现复发或转移后治疗更为棘手。免疫治疗可激活人体本身的免疫系统，依靠自身免疫机制杀灭癌细胞。乳腺癌细胞可随着免疫细胞浸润而发生增殖和凋亡，在这个动态环境中肿瘤特异性抗原通过肿瘤浸润抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APC)在主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)分子上表达，与T细胞受体结合激活抗原特异性的细胞毒性T细胞(antigen-specific cytotoxic T cell，CTL)反应，导致凋亡的肿瘤细胞被吞噬[21]。免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)在TNBC治疗中逐渐被重视，如程序性死亡受体1(programmed cell death l，PD-1)、程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)及细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4)等，近年来不仅被证实可能是潜在的预后标志物，同时也是调节T细胞活化的治疗靶点[22]。靶向PD-1/PD-L1的免疫疗法作为新型治疗方法，主要通过阻断PD-1/PD-L1通路，诱导肿瘤凋亡及破坏免疫逃逸系统，达到杀伤肿瘤的目的。在乳腺癌治疗领域，美国食品及药物管理局已加速批准首个针对TNBC的免疫治疗方案，即阿特珠单抗(Atezolizumab)联合紫杉醇(Abraxane)用于一线治疗无法切除的局部晚期或转移性PD-L1 阳性TNBC，为临床治疗提供了新的选择[23]。

正常状态下，机体免疫系统可以识别并清除肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)中异常增殖的肿瘤细胞，但肿瘤细胞可通过不同策略抑制免疫系统来产生免疫逃逸。传统放化疗可能通过杀伤肿瘤细胞，促进肿瘤特异性抗原释放，刺激树突状细胞成熟，激活T细胞产生反应。而ICIs可防止活化的T细胞失活，从理论上讲，联合治疗可提高免疫系统的抗肿瘤能力，放疗及化疗还可能增加TME中TILs的浸润，提高机体对ICIs的敏感性，联合治疗的有效性及安全性正逐渐被临床试验证实。同时，肿瘤细胞可能通过涉及多个免疫检查点的信号途径产生免疫逃逸，因此不同ICIs的组合可能提高免疫治疗的有效性[21]。此外，ICIs联合抗血管生成药物也是目前的研究热点。新生血管的生成在肿瘤生长、侵袭及转移过程中意义重大，可能与肿瘤的免疫逃逸和耐药性密切相关。抗血管生成治疗可使肿瘤周围血管趋于正常化，促进TILs浸润，减轻免疫抑制[22]。虽然目前初步的试验结果令人振奋，但联合治疗的适宜时机、合理方法和获益人群仍然需要进一步研究验证。

TILs与PD-L1的检测目前研究证实TILs是早期TNBC的预后因素，对接受ICIs单药治疗的患者同样具有预测价值。现有研究主要集中在PD-L1阳性肿瘤患者的临床获益，但PD-L1既可在肿瘤微环境中的活化T细胞上表达，也可在肿瘤细胞上表达，既往试验中PD-L1的检测标准并不统一，为达到相同的效果需要根据免疫标志物的结果进行分层分析[24]。北京协和医院病理科及乳腺外科通过研究PD-L1在TNBC肿瘤细胞上的表达，证实其在TNBC中预后价值不优于TILs上的表达[25]。基于前期的研究结果[26]，美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)在2020年第2版乳腺癌管理指南中建议，对拟使用阿特珠单抗联合白蛋白紫杉醇的TNBC患者进行TILs上PD-L1表达的检测，并将PD-L1阳性表达的阈值界定为≥1%。IMpassion130研究中TILs仅能预测PD-L1阳性肿瘤患者的ICIs疗效，现有临床试验将有望进一步明确乳腺癌患者的免疫标记物，并确定多维免疫分析是否优于目前仅基于PD-L1的疗效预测，从而定制更为精确的免疫疗法[27]。

TILs与联合治疗目前针对ICIs对TNBC的治疗研究已证实这些药物的潜在价值，但单用并非效果最佳；IMPassion130研究中，ICIs与抑制有丝分裂的紫杉烷化疗联用的可能理由是，化疗可能促进肿瘤抗原的释放和ICIs的抗肿瘤反应[28]。同样，联合放疗、靶向治疗或其他免疫治疗可通过产生和放大T细胞反应和抑制免疫检查点来促进疗效。此外，在其他实体瘤中证实有效的ICIs，也逐渐在乳腺癌中进行研究；除前述CTLA-4外，还有T细胞上与PD-1共表达并抑制T细胞活化的淋巴细胞活化基因3分子(lymphocyte-activation gene 3，LAG-3)和黏蛋白结构域蛋白3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，Tim-3)，以及增强T细胞抗肿瘤活性的共刺激受体等[29]。因TILs在TNBC肿瘤微环境中的存在已证明与治疗反应及生存改善相关，通过不同分子机制从特定肿瘤抗原中制备的肿瘤疫苗，可能进一步提高TNBC的治疗效果[7]。

TILs与精准治疗虽然IMpassion130研究结果证实免疫治疗联合化疗的有效性，但免疫相关不良事件(immune-related adverse events，irAEs)同样值得关注。最常见的irAEs包括恶心、疲劳及肌肉痛，还有结肠炎、肝炎和甲状腺功能减退等。从成本效益的角度分析，免疫治疗也并非目前晚期TNBC的一线选择[30]。近日，由中国临床肿瘤学会(Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO)专家委员会牵头，制定肺癌相关ICIs治疗的专家共识，以期指导国内同行进行更好的临床实践[31]。目前乳腺癌领域尚无相关共识，但为最大限度提高ICIs的有效性，并探索其在早期乳腺癌患者的价值，尚需进一步研究以明确PD-L1等在肿瘤细胞和TILs上的表达、最佳阳性阈值界定及TNBC免疫微环境的全景[32]。目前正进行的临床试验中，研究者们正探索预测免疫治疗可靠的生物标志物，除上述TILs浸润比例及PD-L1表达外，还包括肿瘤突变负荷及微卫星不稳定性[33]。随着乳腺癌免疫治疗的发展，将免疫基因表达及TILs纳入预后模型，或有助于现有多基因检测方法的发展[34]。

共识与争议如前所述，NCCN指南中已有TNBC免疫治疗的相关内容，2019年St.Gallen大会中同样进行了针对预后生物标志物的投票。关于TILs，66%的投票者推荐其作为常规病理报告内容，但90%的投票者表示不会根据高TILs水平决定化疗的适应证，且只有28%的投票者所在机构存在常规TILs检测[35]。德国专家组在针对共识的评论中指出，目前尚无PD-1/PD-L1抑制剂在早期TNBC中应用的成熟研究数据，因此德国专家组及79.2%的投票者不支持在早期TNBC中进行常规的PD-L1检测；但对于转移性TNBC，91.5%的专家组成员支持进行TILs上PD-L1的检测[36]。但近期一项针对4个队列的综合分析结果显示，在未接受系统治疗的早期TNBC患者中，sTILs与组织学分级有关，与其他临床病理因素无关；高sTILs水平的患者预后更佳，且预后影响与其他预后因素无关。结合前期研究结果，无论是否有系统治疗，sTILs都有望成为TNBC患者的良好预后指标，并能帮助识别出可能避免化疗的患者[37]。

问题及展望首个免疫治疗药物获批是转移性TNBC精准治疗的重要里程碑，但目前免疫治疗相关问题仍亟待解决，如预测ICIs治疗反应和毒性的生物标志物，确定治疗的最佳方法及目标人群，以及合并自身免疫性疾病和/或免疫抑制状态患者使用的安全性等。随着ICIs进入乳腺癌领域，早期识别和及时管理irAEs，实现治疗风险及临床获益的平衡是优化预后的关键[38]。近期有研究指出，irAE可能预测PD-1抑制剂的治疗效果，当存在irAEs时，患者治疗的应答率从16.6%提高到82.5%，无病生存期从3个月延长到10个月，总生存期则从22个月延长至32个月[39]；提示irAEs可能预测免疫治疗的应答率，从而进一步揭示免疫治疗有效性的潜在生物学机制。此外，乳腺癌中TILs浸润比例不高，既往研究认为多数乳腺癌是免疫“冷”肿瘤，因此通过刺激TILs浸润将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤的联合治疗策略，可能实现患者对免疫治疗的持久应答[21]。如上所述，研究者们以此为目的已进行了多种尝试，包括联合化疗、放疗、靶向治疗和癌症疫苗等；乳腺癌免疫治疗的结果取决于患者选择和治疗方案，提高免疫应答及阻断免疫逃逸可能实现更好的治疗效果。

综上，TILs是一种易于重复检测且价格低廉的生物标志物，关于TILs的研究已初步证实其在免疫治疗中的预后价值。研究者们目前积极探索TNBC的不同治疗方案，从而为实现TNBC的精准治疗提供依据，并优化乳腺癌不同免疫亚型的治疗策略。因肿瘤微环境中TILs可能与化疗和免疫治疗相关，如何使抗肿瘤的免疫杀伤效应更好地在机体免疫系统中得以发挥，寻找提高TNBC免疫原性的联合治疗方法，以提高肿瘤对免疫治疗的反应性并使更多的患者受益，可能是这一领域未来的研究方向[40]。同时，高TILs水平最常见于TNBC的免疫调节亚型，对此类患者进行多基因检测，在早期TNBC患者中开展关于乳腺癌异质性的研究，可能为早期TNBC的治疗提供新思路。