刘延亭 ，张美美 ，代发文，赵宝凯

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干扰素（Interferon，IFN）是机体正常细胞在受诱生剂（包括病毒、细菌和某些化学合成物质）激发后产生的一类低分子量糖蛋白，它具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫及抗肿瘤作用[1-2]。干扰素根据其来源、功能和表面受体等的不同，可分为三大类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[3-4]。Ⅰ型干扰素由白细胞产生，抗病毒作用为主，免疫增强为辅。主要包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω；Ⅱ型干扰素由活化的T细胞和NK细胞产生，免疫增强为主，抗病毒作用为辅，只有IFN-γ；Ⅲ型干扰素是由上皮细胞和黏膜细胞产生，功能作用与Ⅰ型干扰素类似，抗病毒为主，主要是IFN-λ。目前，Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的研究，特别是Ⅰ型，较为成熟与广泛，包括抗病毒机理和抗病毒效果等，自从1987年开始，科学家用基因工程方法生产的Ⅰ型干扰素进入了工业化生产后，已有几十个Ⅰ型干扰素产品投放到市场，广泛应用到恶性肿瘤、亚急性重症肝炎、肝纤维化（早期肝硬化）、感染与损伤性疾病、骨髓增生异常综合症、病毒性疾病、系统性硬皮病、异位性皮炎、风湿性关节炎等症状的治疗当中。

干扰素具有高度的种属特异性，故人的干扰素对动物无效，并且不同病毒、不同细胞对干扰素敏感性不同。Ⅲ型干扰素相对于Ⅰ和Ⅱ型而言发现的较晚，2003年，Sheppard等[5]人利用反向生物学原理鉴定出一组新型的白细胞介素IL-28A、IL-28B和IL-29，2004年，Dumoutier L等[6]在对其生物学功能进行进一步的研究后，将他们正式定名为Ⅲ型干扰素家族。人Ⅲ型干扰素基因结构与IL-10家族相似，但氨基酸水平上与干扰素更相似，分为3个亚型，Kotonko等[7]将其分别称为IFN-λ1 （IL-29）、IFN-λ2（IL-28A）和IFN-λ3（IL-28B），IFN-λ4是在2013年才被Prokunina等[8]发现和定义。猪Ⅲ型干扰素的亚型不同于人，到目前为止，在猪身上只分离到IFN-λ1 和IFN-λ3两种亚型[9]。Ⅲ型干扰素虽然发现较晚，但在人疾病治疗中的应用研究速度较快，如在治疗登革热、慢病毒等方面取得了显著进展，反观动物Ⅲ型干扰素，近些年，相关研究虽已开展，但其研究的深度和广度仍相当有限，且难以广泛应用于临床治疗，包括猪Ⅲ型干扰素。鉴于现今非洲猪瘟等病毒在猪场的广泛存在和严重威胁，Ⅲ型干扰素具有的在上皮细胞抗病毒及免疫调节上的特殊作用，以及对靶细胞的选择性[10]和副作用小等优势就显得尤为重要，因此探索猪Ⅲ型干扰素的抗病毒和免疫调节作用机制及其对猪病毒性疫病在实际治疗上的深入研究至关重要。本文结合Ⅲ型干扰素的相关研究成果对猪Ⅲ型干扰素的结构特征、诱导和调节机制及抗病毒应用方面进行综述，以期为后期猪病毒病的干扰素治疗提供参考。

1 结构特征

IFN-λ细胞受体是异二聚体IL28R，由IFN-λ-1（IFNLR1）和IL-10亚单位β（IL-10RB/IL-10Rβ）构成[11-12]，猪IFN-λ位于猪14号染色体上[13]，猪IFN-λ1和IFN-λ3开放阅读框分别有576和588个核苷酸，编码191和195个氨基酸，N端分别含有19和23个氨基酸的信号肽。与Ⅰ型干扰素类似，成熟的IFN-λ具有4～5个短环连接螺旋构成的α螺旋结构。猪IFN-λ1和IFN-λ3分别有4和6个保守性半胱氨酸残基，分子内形成2和3个二硫键，氨基酸潜在有1和2个糖基化位点，猪IFN-λ1预测是在56-68位上，猪IFN-λ3预测是在71-74和111-114位上，猜测N端糖基化位点可能与干扰素肽的成熟有关[9]。蛋白质水平上，猪IFN-λ1和IFN-λ3氨基酸同源性不到60%。基因结构上，猪IFN-λs含有5个外显子，1、3、5外显子可能与螺旋结构的形成有关，在启动子区域，存在几个IFN调节因子结合区[14]。

2 病毒诱导和信号传导途径

IFN各型之间通过各自的信号传导通路，产生干扰素诱导基因，抑制病毒复制与扩散、干扰肿瘤生长并调动机体的免疫调节功能发挥生物学作用。IFN-λ在细胞介导的信号传导途径与IFN-α等Ⅰ型干扰素类似，目前认为主要是JAKSTAT途径。非受体性蛋白质酪氨酸激酶超家族中的Janus激酶（JAK）家族及信号转导子和转录活化子（STAT）家族是细胞对Ⅰ型和Ⅲ型干扰素等细胞因子反应的一些基本蛋白质分子[15]。病毒感染动物机体后，被病原模式识别受体（PRRs），包括TIG-1样受体（RLR）、Toll样受体（TLR）及DNA识别受体Ku70识别，产生一系列活化物质，RLR通过定位于过氧化酶体和线粒体的线粒酶体抗病毒信号蛋白（MAVs），与TLR等共同刺激生产干扰素调节因子 （ IFRs） 和细胞核因子（NF-κB）等，进而激活产生IFN-λs。这其中，Ku70是一种新型的细胞内DNA识别受体，在人胚肾293细胞中，Ku70主要借助IRF1和IRF2来诱导IFN-λ的产生，对IFN-α等Ⅰ型干扰素无明显影响[16]。产生的IFN-λs与细胞内受体IFNFR结合，包括IFN-λR1和IL-10Rβ，形成的复合物进而激活JAK1、JAK2和TYK2激酶，从而使STAT1和STAT2磷酸化，STAT1与STAT2磷酸化后再与第三个蛋白IFR9结合形成一个转录复合物，即干扰素刺激基因因子3（ISGF3），ISGF3促使ISG和其它能抑制病毒感染的效应因子表达，如Mx1、PKR，以及干扰素转录调节因子IFR1和IFR7，反过来，IFR1和IFR7又调节IFN-λs的表达。这其中，JAK2是STAT1磷酸化过程中必不可少的，JAK2在细胞中介导的抗病毒信号传导只产生IFN-λs[17-20]。

3 分布和调节机制

与Ⅰ型干扰素受体在机体内广泛分布有所不同，作为能够特异性结合Ⅲ型干扰素的受体，IFN-λR1只在特定的细胞和组织中表达，尤其是上皮细胞丰富的组织，如胃肠道、泌尿生殖道等，一些免疫细胞也可以产生，如B细胞、巨噬细胞，而在造血系统（B细胞除外）和神经系统则很少能检测到[21-22]，IFN-λ具有的特有组织特异性生物学功能，可使IFN-λ应用于临床治疗中可能不会产生与IFN-α相似的造血系统和神经系统方面的副作用。上皮细胞中IFN-λ表达量高是因为其含有较多MAVs的过氧化物酶体。虽然上皮细胞产生较多的IFN-λ，但骨髓细胞仍然是受双链RNA（Poly I:C）和病毒刺激产生IFN-λ最为丰富的组织[23]，除肠上皮细胞外，肠免疫细胞在受到Poly I:C刺激后，也能产生一定量IFN-λ。除了在表达量上的区别外，产生的干扰素种类也有差异，肠上皮细胞受到Poly I:C刺激，只能产生IFN-λ2和IFN-λ3，而肠免疫细胞还能产生IFN-α5和IFN-β[24]。

由于IFN-λ和IL-10共用IL-10Rβ受体，因此IFN-λ与IL-10家族中的细胞因子之间的相互关系就变得比较复杂。Jordan等[25]通过实验证实，IL-10的阻断抗体能够增强IFN-λ的活性，相反，IL-10的存在能抑制IFN-λ活性，暗示两者之间对IL-10Rβ可能存在一定的竞争关系。相应地，IL-22（通过IL-10Rβ和IL22Rα信号传导）能够增强IFN-λ的信号传导和抗病毒活性[26]。尽管IFNAR和IL-10Rβ广泛存在于许多细胞和组织，但IFNLR1多表达于上皮细胞[24]，这也就解释为何IFN-λ能在上皮细胞中发挥重要的抗病毒作用。

Ⅰ型和Ⅲ型干扰素在转录水平上的调节机制并不相同，不同于Ⅰ型干扰素，如IFN-β，诱导需要AP1、IFR3、IFR7、NFκB等多因子的结合才能启动，Ⅲ型干扰素只需要IFR3、IFR7和NFκB三者即可启动诱导反应，且IFRs和NFκB独自发挥作用也可以诱导IFN-λs产生，该发现能够直接或间接说明，动物机体受到病原感染后，更容易启动IFN-λs应答，不易受到其他因素的干扰；同时由于需要较少的转录因子参与，IFN-λs比其他类型干扰素也更容易被诱导产生；二是作为IFR家族中第一个被鉴定出来的IFR1，是所有类型干扰素必需的结合位点。IFR1被认为在抗病毒应答中具有极其重要的作用，同干扰素发挥功能不可分割。最新的研究证明IFR1并不能诱导产生IFN-β，但的确可以在对RNA病毒应答过程中控制Ⅲ型IFN的表达[19,27-31]。

4 抗病毒应用

IFN-λ可以在胃肠道、呼吸道、生殖道等上皮细胞丰富的组织诱导多种抗病毒蛋白的表达，因此关于IFN-λ的抗病毒研究也主要着重在此。对猪而言，研究人员研究的对象主要集中在猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）、猪轮状病毒（Porcine Rotavirus，PoRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV）、猪口蹄疫（Food and Mouth Disease Virus，FMDV）等，这其中对PEDV的研究最为深入和广泛，研究表明猪Ⅲ型干扰素在粘膜表面发挥着Ⅰ型干扰素不可替代的作用。

4.1 猪流行性腹泻病毒

PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属，能引起仔猪和育肥猪急性肠道传染病，即流行性腹泻病。该病可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率高。病毒存在于肠绒毛上皮细胞和肠系膜淋巴结，随粪便排出后，污染环境、饲料、饮水、交通工具及用具等而传染。随着我国猪瘟、伪狂犬等重大疫病的免疫稳定，猪流行性腹泻病、猪繁殖与呼吸综合征与非洲猪瘟逐渐成为威胁猪场健康的最主要的三个疫病。以PEDV为模型，在研究猪Ⅲ型干扰素的抗病毒活性及抗病毒机制方面，我国科学家已走在世界前列。

Haiyan等[32]研究人员首先验证了猪IFN-λ3对PEDV的抗病毒效果。他们通过基因重组的方式获得表达猪IFN-λ3的原核重组融合蛋白，经镍柱纯化后，与Vero E6细胞作用，发现：在PEDV CV777株感染前用重组蛋白处理的细胞组，抗病毒效果最好，其次为病毒与重组蛋白同时作用细胞组，病毒感染后再用重组蛋白处理细胞，对病毒的抑制效果最差。同时，试验人员用不同含量的重组蛋白前处理细胞，结果显示，当重组蛋白浓度为100ng/mL时，几乎能完全抑制PEDV的复制。

Lin L等[33]通过免疫荧光和荧光定量PCR试验证明，重组的猪IFN-λ1和IFN-λ3均能在Vero E6细胞和猪肠上皮细胞系J2（IPEC-J2）上对PEDV病毒表现出较强的抗病毒活性，包括PEDV的G1型（CV777毒株）和G2型（LNCT2毒株）。但两种亚型的IFN-λ在抗病毒特性上存在一定的差异，IFN-λ1的抗病毒活性主要体现在感染早期的抗病毒感染，它在IPEC-J2细胞上对PEDV的抗病毒活性要比IFN-λ3弱的多，特别是对G2型LNCT2病毒。相对于IFN-α，IFN-λ的两个亚型在抑制PEDV病毒感染增殖方面表现理想，具体表现在IFN-λ在IPEC-J2细胞上能够比IFN-α诱导产生更多的ISGs（特别是ISG15、OASL和MxA），IFN-λ3还能够诱导产生较高含量的IFITM3。

Mingzhi Z等[34]证明，在肠道上皮细胞（IPEC-J2），无论是mRNA水平还是蛋白质水平，IFN-λ1比IFN-α能诱导产生更强烈和持续的ISG上调。在mRNA水平上，IFN-λ1能刺激产生132个ISG基因，而IFN-α只产生42个；在蛋白质水平，IFN-λ1能刺激产生47个ISG蛋白，而IFN-α只产生8个。特别是ISG15，USP18，OASL和 RSAD2，研究人员通过RTPCR试验证明，在IFN-λ1诱导后3～24h，就能产生持续性表达上调，而通过功能分析表明，ISG15和RSAD2对PEDV的感染抑制具有剂量依赖性。

在IFN-λ在动物机体内抑制PEDV增殖的过程中，PEDV也在形成自己的逃逸机制。科学家在进行PEDV如何逃避先天免疫的研究中，发现PEDV NSP1蛋白阻断了IRF1的核异位、降低过氧化物酶体的数量来逃避Ⅲ型干扰素的免疫应答[35]。Xufang D等[36]还发现冠状病毒核糖核酸内切酶是一类重要的毒力因子，在上皮细胞中能显著抑制猪Ⅰ型和Ⅲ型干扰素的应答。

4.2 猪轮状病毒

轮状病毒是人畜共患腹泻病的重要病原之一。轮状病毒感染能侵害人类和许多种畜禽，不仅感染率高，有时发病率也相当高，对人类健康和畜牧业的发展都有较大的危害。董波等[37]对2014～2017间来自闽西地区规模化猪场的173份腹泻病例进行了PoRV的实验室诊断，发现2014～2017年间PoRV的阳性率分别为22.22%、30.90%、23.80%、2.70%。尹宝英等[38]对2018年陕西162腹泻样品进行了PoRV的样品检测，阳性检出率为9.48%。

殷玥等[39]首次应用PoRV为模型，研究猪III型干扰素对其的抗病毒活性及机理。他们通过克隆藏猪IFN-λ3成熟肽基因，构建原核表达载体 pET-32a（+）-mZPoIFN-λ3，成功表达了藏猪IFN-λ3重组蛋白，该重组蛋白经亲和层析纯化，比活性能约2×103.0IU/mg。将原核表达产物以不同的剂量预处理IPEC-J2细胞和MA104 细胞24h后，再接种0.1MOI轮状病毒SC-R株，于接种后不同时间收集细胞悬液。qPCR 检测样品中VP6基因的 mRNA水平。结果显示不同剂量的原核表达产物在病毒接种IPEC-J2细胞和MA104细胞后均能有效地抑制SC-R株的增殖，并呈现一定的剂量和时间依赖，且低浓度IFN-λ3（100ng/mL和10ng/mL）在IPEC-J2细胞的抗轮状病毒活性显著强于在MA104细胞的活性，高浓度（1000ng/mL）则差异不显著。同时研究人员为了证实IFN-λ3和IFN-α联合应用能否增强抗PoRV活性，将重组IFN-λ3和IFN-α以不同剂量单独或联合应用预处理IPEC-J2细胞，再接种SC-R株病毒，收获细胞液，测定病毒滴度。结果显示所有剂量二者联合应用均没有IFN-λ3单独应用抑制SC-R株增殖的活性强。为探究其中机制，相对荧光定量测定下游抗病毒蛋白 MxA、OASL和ISG15转录情况，发现单独使用IFN-λ3诱导的下游抗病毒蛋白转录均高于二者联合应用。

4.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒

猪繁殖与呼吸综合征的病原体为动脉炎病毒属的成员，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，易变异，虽然现在市场上对于该病防控的疫苗种类众多，但在安全性、有效性方面都存在或多或少的问题。Sang等[40]利用肺泡巨噬细胞（PAM）和MARC-145两种细胞研究了猪IFN-λs对PRRSV的抑制和保护效果。他们用含不同量的IFN-λs多肽处理细胞，然后接种病毒，发现：0.1ug/mL的猪IFN-λ1和IFN-λ3在PAM细胞上能分别产生40%和20%的保护，而同一条件下，IFN-a1能产生80%的保护；在MARC145细胞上，0.01μg/mL的猪IFN-λ1就能对PRRSV产生接近完全的保护，与IFN-β效果类似，同一浓度下猪IFN-λ3只能提供约20%的保护。Dang等[41]人利用原核表达载体克隆构建了猪IFN-λ1（IL-29）重组蛋白，测得的生物学活性约1.8×103.0U/mL，他们用该制备的不同剂量的重组IFN-λ1感作MARC145细胞，再接种CH-1a株PRRSV，收集不同时间段的培养上清液，通过病毒滴度测定和荧光定量PCR检测，证明50U作用剂量的IFN-λ1对PRRSV能产生约60%的抑制，当200U作用剂量时，PCR几乎都检测不到RNA存在，证明该剂量下能对PRRSV产生约100%的抑制，以及该抑制作用具有剂量依赖性。

猪IFN-λ1作为PRRSV DNA疫苗佐剂也有相关研究，Luping D等[42]通过将猪IFN-λ1与PRRSV GP5蛋白融合构建DNA疫苗，免疫小鼠，发现与对照组相比，IFN-λ1能显著增强小鼠的体液和细胞免疫应答，能产生更强的中和抗体和IFN-γ表达水平。

4.4 猪口蹄疫

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的，发生于牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。世界动物卫生组织将口蹄疫列为动物A类烈性传染病，严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。Perez-Martin等[43]研究人员通过实验证明，猪IFN-λ3在预防猪FMDV时也能发挥非常重要的作用。他们利用人腺病毒5型重组构建了表达猪IFN-λ3的Ad5-PoIFN-λ3载体，免疫10头猪，结果显示：相对于对照组，免疫组有7头猪无FMDV症状或病毒血症，另外3头表现出温和或延迟的临床症状；基因分析显示，Ad5-PoIFN-λ3在猪肠上皮细胞能诱导产生较强的ISGs，而在外周血淋巴细胞中诱导的ISGs非常有限。

另外，Dang等[41]人利用原核表达载体克隆构建的猪IFN-λ1（IL-29）重组蛋白，对猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）的抑制效果进行了研究，结果表明，重组IFN-λ1在对PK15细胞50U、100U和200U的剂量作用下，PRV在PK15中形成的蚀斑数分别减少42%、56%和71%，证明重组IFN-λ1对PRV也具有相当好的抑制作用，抑制效果与剂量相关性明显。对Ⅲ型干扰素的体外药代学实验也显示，使用IFN-λ及IFN-α/-β分别作用HaCat细胞后，IFN-λ诱导ISGs产生和衰减缓慢，而IFN-α则非常迅速[44]。这提示，Ⅲ型干扰素比Ⅰ型干扰素发挥更加长效持久的生物学功能。

先天免疫反应是动物机体抵御病毒入侵的第一道防线，干扰素，包括Ⅰ型和Ⅲ型干扰素就会被激活来抵御病毒的感染，它们是动物机体天然免疫反应的重要组成部分。Ⅲ型干扰素不同Ⅰ型干扰素的重要特点在于，Ⅲ型干扰素受体主要表达于上皮细胞丰富的黏膜组织，更容易直接暴露接触病毒，引发快速、持续、低水平的局部免疫应答，在触发主要由Ⅰ型干扰素介导的全身性免疫应答之前，发挥抗病毒作用，将病毒限定在局部区域，以减少由Ⅰ型干扰素引起的可能的炎症反应。随着近几年，Ⅲ型干扰素在抑制人登革热病毒、诺如病毒、SARS、中东呼吸综合征、新冠病毒等方面表现出来的突出效果，Ⅲ型干扰素的研究已愈来愈受到科研人员的重视。