李金涛 李时军 宋章兴 向 奎 赵 华 崔应东 田朝晖

1.湖北民族大学医学部，湖北恩施 445000；2.湖北省恩施土家苗族自治州民族医院泌尿外科、男科，湖北恩施 445000；3.湖北省恩施土家苗族自治州民族医院医务部，湖北恩施 445000

男性不育是一个严重的全球性医学和社会问题，据研究表明大约有15%的夫妇受到不育症的影响，其中40%～50%的病例归因于男性不育症[1]。约有45%的男性不育原因不明，影响因素包括精索静脉曲张、睾丸衰竭、内分泌功能障碍、生殖道感染、肥胖、高龄、遗传因素等[2]。腺嘌呤是一类肿瘤化疗药物，但由于其可抑制生精细胞的产生从而被应用于建立动物不育模型[3]。本研究应用不同剂量的富硒当归淫羊藿方对腺嘌呤造模后的大鼠进行干预，观察药物对模型大鼠睾丸超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及血清卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、睾酮（testosterone，T）的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取6 周龄雄性SPF 级SD 大鼠58 只，体重150～180 g，由三峡实验动物中心提供（合格证号：SCXK 鄂2017-0012）。按照中华动物伦理学要求饲养和处理动物，造模前适应性饲养1 周，普通饲料，定时喂食，自由饮水，12 h 光照/d，室温保持在20～26℃，饲养于恩施州中心医院湖北硒与人体健康研究院。

1.2 药物与试剂

富硒当归淫羊藿方中当归30 g（恩施富硒药材）、淫羊藿20 g（恩施富硒药材）、黄芪15 g（恩施富硒药材）、丹参30 g、菟丝子20 g、小茴香15 g，由恩施州民族医院药剂科提供，常规方法煎煮，浓缩至生药量1.66 g/mL，经测得药物含硒量为50 μg/mL，4℃冰箱保存。腺嘌呤（批号：S09S10D97125），购自上海源叶生物科技有限公司；SOD 试剂盒（批号：20191210）、MDA 试剂盒（批号：20191209）购自南京建成生物工程研究所；LH 检测试剂盒（批号：SE0RD094566）、FSH检测试剂盒（批号：SE0RD095822）、T 检测试剂盒（批号：SE0RD098100）均购自武汉云克隆科技股份有限公司。

1.3 仪器

NanoDrop2000 超微量分光光度计（Thermo 公司）；D3024R 台式高速冷冻型微量离心机（DragonLab 公司）；AD18 高速分散匀浆机（上海昂尼有限公司）；KD-2258石蜡切片机、KD-P 摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；Pannoramic SCAN 数字全扫仪器（3DHISTECH 公司）。

1.4 方法

1.4.1 建立模型 随机选取10 只雄性SD 大鼠作为正常组，余下大鼠参照随机数字表法分为四组：模型对照组，富硒当归淫藿方高、中、低剂量组，各12 只。正常组大鼠灌胃0.9%氯化钠溶液，灌胃量为10 mL/（kg·d），模型对照组和富硒当归淫羊藿方高、中、低剂量组灌胃500 mg/（kg·d）腺嘌呤混悬液，灌胃量为10 mL/（kg·d）。灌胃共15 d，造模结束。

1.4.2 实验药物干预 富硒当归淫羊藿方高、中、低剂量组大鼠依据《实验动物学》[4]确定给药剂量，高剂量组每只大鼠灌服富硒当归淫羊藿方20.92 g/（kg·d），中剂量组每只大鼠灌服富硒当归淫羊藿方10.46 g/（kg·d），低剂量组每只大鼠灌服富硒当归淫羊藿方5.23 g/（kg·d），连续灌胃30 d。

1.4.3 取材 实验第46 天，称重各组大鼠，用4%水合氯醛麻醉大鼠，心脏取血8～10 mL 于玻璃试管中，静止3 h，离心4 min（4000 r/min，13.5 cm），吸取血清放置于-80℃低温冰箱保存；分离睾丸组织，右侧睾丸置于福尔马林液中固定，用于制备睾丸病理切片，左侧睾丸制备成组织匀浆，用于测定SOD 和MDA 的含量。

1.4.4 检测项目 观察各组大鼠体重、饮食、尿量等一般状况；WST-1 法检测睾丸组织匀浆SOD；酶联免疫吸附法检测MDA 含量；酶联免疫吸附法检测血清性激素FSH、LH、T 含量；比较各组大鼠睾丸病理切片结果。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态观察

实验开始前各组一般状态良好，饮食、尿量均正常，毛色光鲜亮丽。造模第4 天开始，模型对照组和富硒当归淫羊藿方各剂量组逐渐出现饮食量减少，尿量逐渐增加（需每日更换垫料），饮水量多，体重下降，弓背，毛发失去光泽，甚至逐渐出现死亡。造模结束后，模型对照组，富硒当归淫羊藿方高、中、低剂量组各死亡1 只。死亡大鼠经解剖后，肺部未发现药液残留及出血点，排除灌胃致死的原因，肾脏出现肿大与出血点，提示因为肾衰竭等原因致死。开始进行实验药物干预后，富硒当归淫羊藿方各剂量组逐渐出现饮食量增加，体重增加，尿量逐渐恢复如常，毛发也逐渐恢复光泽。灌胃腺嘌呤大鼠出现竖毛、眯眼、弓背等临床表现，见图1。

图1 灌胃腺嘌呤大鼠的临床表现

2.2 富硒当归淫羊藿方对大鼠睾丸组织匀浆SOD、MDA 的影响

与正常组比较，模型对照组睾丸组织匀浆SOD 下降，MDA 上升，差异均有高度统计学意义（均P ＜0.01）；与模型对照组比较，富硒当归淫羊藿方高、中剂量组SOD 均不同程度升高，差异均有高度统计学意义（均P ＜0.01），但富硒当归淫羊藿方低剂量组与模型对照组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；与模型对照组比较，富硒当归淫羊藿方高、中、低剂量组MDA 均不同程度降低，差异均有高度统计学意义（均P ＜0.01）。见表1。

表1 富硒当归淫羊藿方对大鼠睾丸组织匀浆SOD、MDA 的影响（）

表1 富硒当归淫羊藿方对大鼠睾丸组织匀浆SOD、MDA 的影响（）

注：与正常组比较，##P ＜0.01；与模型对照组比较，**P ＜0.01。SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

2.3 富硒当归淫羊藿方对大鼠血清FSH、LH、T 的影响

2.3.1 血清FSH 与正常组比较，模型对照组血清FSH上升，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；富硒当归淫羊藿方低剂量组血清FSH 与模型对照组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；与模型对照组比较，富硒当归淫羊藿方高、中剂量组血清FSH 下降，差异均有高度统计学意义（均P ＜0.01）。见表2。

2.3.2 血清LH 与正常组比较，模型对照组血清LH上升，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；富硒当归淫羊藿方低剂量组血清LH 与模型对照组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；与模型对照组比较，富硒当归淫羊藿方高、中剂量组血清LH 下降，差异均有高度统计学意义（均P ＜0.01）。见表2。

2.3.3 血清T 与正常组比较，模型对照组血清T 下降，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；富硒当归淫羊藿方低剂量组血清T 与模型对照组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；与模型对照组比较，富硒当归淫羊藿方高、中剂量组血清T 升高，差异均有高度统计学意义（均P ＜0.01）。见表2。

2.4 睾丸组织病理学结果

正常组睾丸结构正常，生精小管边界完整，管腔饱满，腔内可见成熟精子，生精细胞层次分明，间质细胞排列整齐；模型对照组睾丸生精小管病变严重，出现基膜塌陷，层次减少，排列不齐，生精小管间质疏松水肿，可见生精细胞变性坏死，成熟精子减少，残存的支持细胞管腔呈空洞样；富硒当归淫羊藿方低剂量组与模型对照组比较，形态稍有好转，生精小管结构可见；富硒当归淫羊藿方中剂量组曲细精管形态有所恢复，管壁分层可见，少量的生精细胞可见。在生精小管管腔内有积液充满管腔，与模型对照组比较有了明显好转；富硒当归淫羊藿方高剂量组可见曲细精管形状规整，生精小管管壁结构良好，生精细胞明显增多，可见精子细胞，生精小管间质有轻微的疏松水肿和轻微的纤维增生。总体改善程度较富硒当归淫羊藿方低、中剂量组效果好。见图2。

表2 富硒当归淫羊藿方对大鼠血清FSH、LH、T 的影响（）

表2 富硒当归淫羊藿方对大鼠血清FSH、LH、T 的影响（）

注：与正常组比较，##P ＜0.01；与模型对照组比较，**P ＜0.01。FSH：卵泡刺激素；LH：黄体生成素；T：睾酮

图2 富硒当归淫羊藿方对大鼠睾丸组织病理组织结构的影响（HE，200×）

3 讨论

腺嘌呤是氮杂环嘌呤类化合物，临床上被应用于预防各种原因导致的白细胞减少症[5]。但由于腺嘌呤可导致慢性的肝肾功能不全，影响大鼠睾丸功能，因此也被用于构建男性不育动物模型[6]。其作用机制包括以下5 个方面。首先，大量摄入腺嘌呤后，腺嘌呤代谢产物尿酸会因过饱和形成尿酸结晶沉积于肾小管，造成肾小管堵塞和炎症反应；其次，摄入大量的腺嘌呤使黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活性增加，从而产生大量氧自由基，减少精子和性激素的生成；同时腺嘌呤也会影响17β 羟基类固醇脱氢酶（17βhydroxysteroid dehydrogenase，17β-HSD）活性，导致T合成减少。最后，腺嘌呤也可导致肾素血管紧张素系统被破坏，影响性腺的血液循环[7-10]；最新研究还表明，腺嘌呤也可引起间质细胞转化生长因子-β（Transformed growth factor-β，TGF-β）的表达增加和对称性二甲基精氨酸（SMDA）蛋白的表达异常，使精子的产生受到抑制[11]。灌胃腺嘌呤后，大鼠会出现饮食下降、尿多、饮水量多、体型消瘦、弓背及毛发失去光泽等特点，本研究在大鼠造模期间逐渐出现上述症状，一定程度提示造模的成功，符合不育动物模型的临床表现。

氧化应激是导致精液质量下降的原因之一，其中氧化应激是由于产生过多活性氧和自由基引起。精子由于缺少细胞质的保护容易受到活性氧的有害影响[12-13]。活性氧攻击精子的过程中会产生MDA，因此MDA 的含量被广泛用于反映精子所遭受的过氧化损伤的水平[14]。Kefer 等[15]认为机体除了存在大量的氧化剂，也存在许多抗氧化剂。SOD 是一类重要的氧化剂清除剂，可催化超氧化物转化为氧气和过氧化氢；Walczak Jedrzejowska 等[16]认为微量元素硒也是一种非酶类抗氧化剂，可防止精子DNA 的氧化损伤。实验表明，缺硒可导致生精上皮的萎缩、精子生成和成熟的障碍[17]。性激素对精子的生成也起着重要的作用，性激素含量的异常将影响精子的生成。本研究结果显示，与正常组比较，模型对照组SOD 活力下降、MDA 含量上升，血清性激素FSH、LH、T 水平异常，提示过量的腺嘌呤在模型对照组大鼠体内蓄积，通过氧化应激造成大鼠睾丸的损伤。

湖北恩施地区有“世界硒都”[18]的称号，有许多富硒的中草药。富硒当归淫羊藿方由当归、淫羊藿、丹参、菟丝子、黄芪、小茴香6 味中草药组成。其中当归、淫羊藿、黄芪均为恩施富硒药材，经权威部门检测当归含硒量约为7.45 mg/kg，淫羊藿含硒量约为6.47 mg/kg，黄芪含硒含硒量约为14.47 mg/kg[19]。研究表明，当归中黄酮类化合物具有明显的抗氧化作用，可使血清中SOD 活力明显增高及MDA 含量降低；淫羊藿也具有延缓性腺衰老、促进性激素分泌、增加精子数量的作用，用淫羊藿灌胃后的肾阳虚大鼠血清睾酮含量增加；菟丝子的提取物可增加精液SOD 活力、降低MDA 含量，并对氧化应激造成睾丸损伤起保护作用；黄芪是另一类抗氧化的中药材，黄芪可降低TGF-β 的表达和SMDA 蛋白的异常表达[20-27]，陈启云等[28]运用黄芪多糖干预沙门菌下暴露的大鼠，生精细胞的调亡和睾丸组织的破坏得到明显的缓解；丹参也是一种具有多重作用的中药材，除了具有抗炎、抗细胞凋亡的等作用外，丹参能降低MDA 的损伤，并提高SOD 的活性；另有研究也表明小茴香在清除超氧阴离子和抗氧化方面也具有重要的作用[29]。本研究结果显示，灌胃富硒当归淫羊藿方中药合剂后，与模型对照组比较，富硒当归淫羊藿方高、中剂量组大鼠出现了体重增加、SOD增加、MDA 水平降低、性激素水平趋于正常等变化，提示富硒当归淫羊藿方能一定程度缓解腺嘌呤对大鼠睾丸的损害。富硒当归淫羊藿方低剂量组情况较模型对照组虽有所好转，但差异无统计学意义（P ＞0.05），提示低剂量的富硒中药不能使大鼠生精功能恢复正常。富硒当归淫羊藿方高剂量组与模型对照组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），提示高剂量富硒中药可以改善腺嘌呤灌胃后对大鼠睾丸的氧化应急损伤，能使生精功能恢复正常。但本研究尚未细致探讨不同硒浓度是否对腺嘌呤造模后大鼠睾丸SOD、MDA 及血清性激素产生影响，故需后续实验予以证明。

综述所述，富硒当归淫羊藿方可通过提升睾丸SOD 活力、降低睾丸MDA 水平，维持性激素FSH、LH、T 的稳定，一定程度上缓解腺嘌呤对睾丸氧化应激的损伤，维持睾丸性激素平衡。