柯俊泉，董 忠 ，潘廷明，汪伟剑

（福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003）

膝关节骨性关节炎（KOA）是中老年人的常见病和多发病。有调查报告指出，60 岁以上的老年人KOA 的患病率为50%，75 岁以上的老年人KOA 的患病率为80%[1-2]。该病主要的临床特点为关节软骨组织退变、软骨丢失、软骨下骨改变及滑膜炎等关节组织病变。该病可导致患者出现患侧膝关节肿痛、膝关节活动受限等，甚至可发生严重的关节畸形。随着临床上对KOA 病理机制研究的不断深入，相关的研究人员越来越关注软骨细胞凋亡与KOA 进展之间的关系[3]。软骨组织中的细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主有序的死亡，属于细胞的程序性死亡。软骨细胞凋亡的发生机制非常复杂，但其凋亡过程具有独特性。软骨细胞的凋亡过程与基质降解具有紧密的关联性[4-5]。当某些病理因素作用于软骨细胞时，细胞凋亡机制可被启动。细胞的过度凋亡可间接导致基质合成相应减少，软骨细胞失去维持内环境稳定的功能，从而可形成恶性循环。bcl-2 基因是参与关节软骨细胞凋亡的相关原癌基因之一。bcl-2 家族中有许多可促进软骨细胞凋亡和抑制软骨细胞凋亡的成员，包括bcl-2、bax 和bcl-x 等。软骨细胞的大量凋亡与bcl-2和bax 失衡有关[6]。

1 bcl-2、bax 在软骨细胞凋亡中的作用

bcl-2 家族主要是通过表达蛋白的相互作用来实现调控软骨细胞凋亡的目的。软骨细胞凋亡是指在一定的生理或病理因素影响下，软骨细胞自主启动死亡程序。而当局部软骨组织发生损伤或有相关的凋亡因子介入，迫使大量的软骨细胞不得不启动凋亡程序时，细胞外基质的合成与降解可失衡，凋亡小体的数量可增多，从而可使软骨细胞无法维持内环境的稳定。在bcl-2 家族中，bcl-2 和bax 是一组细胞凋亡调控基因。目前，医学界对bcl-2 和bax 的结构和生理功能都有深度的研究。

软骨细胞凋亡是一个有多种细胞因子、多种细胞信号转导通路参与的复杂的病理过程。该过程主要涉及上游和下游信号通路。上游信号通路包括MAPKs、PI3K-Akt、JAKs/statl、Wnt/β-Catenin 和核因子kB。下游信号通路主要涵盖死亡受体途径，以及与bcl-2、bax 关系密切的线粒体途径和内质网应激反应性凋亡途径[7]。bcl-2 和bax 可通过表达的蛋白直接或间接参与到凋亡信号的转导通路中，从而实现调节细胞凋亡的作用。bcl-2 可通过表达蛋白实现抗凋亡的作用，其表达的蛋白主要锚定于线粒体膜、内质网和核膜等。因此，bcl-2 蛋白可存在于内质网上，这种结构使其可阻断Ca2+向细胞质的流动，间接促使Ca2+依赖性核酸内切酶失去活性，从而实现抑制细胞凋亡的目的。另外，bcl-2 蛋白还可改变线粒体巯基的氧化还原状态，通过膜电位调节细胞的凋亡，并可通过抑制caspase 的激活及细胞色素c（cytc）、凋亡诱导因子（AIF）等重要蛋白的释放，起到阻抑细胞凋亡的作用[8]。因此，bcl-2 蛋白结合相关因子常被用于评价bcl-2 家族基因在细胞凋亡中的作用。王振龙等[9]通过药物干预的方式降低肿瘤细胞中bcl-2 的表达，增加其中bax 的表达，同时采用蛋白质印迹法（Western blot）检测到肿瘤细胞中CHOP 的表达上调。CHOP 是内质网应激介导凋亡的重要促进因子。张铁山等[10]通过进行氟诱导乳鼠软骨细胞凋亡机制实验发现，凋亡的软骨细胞具有细胞核紧缩凝聚、内膜结构不清、内质网扩张的特点，并显露大量的空泡，其中的bcl-2 蛋白表达也明显降低。bax 表达的蛋白是一种整合膜蛋白，主要散落在细胞的内膜、细胞质和细胞核中，通过形成同型二聚体促进细胞的凋亡。bcl-2 蛋白可与bax 竞争性地结合，并形成更为稳定的bcl-2/bax 异二聚体。bcl-2/bax 二聚体可阻抑bax/bax 诱导的细胞凋亡。因此，bcl-2/bax 可构成一个平衡系统。在该系统中，bcl-2 蛋白占优势时，细胞可生存，bax 蛋白大量表达则可加速细胞的凋亡[11]。二者的蛋白表达比值可控制细胞的生存与凋亡。

2 软骨细胞凋亡对KOA 的影响

KOA 是由于机械和生物因素的长期累积作用，使软骨细胞过度凋亡，细胞外基质的合成与代谢发生紊乱所导致的膝关节疾病[12]。软骨细胞是成熟软骨中唯一能维持内部环境平衡的细胞类型。这类细胞过度凋亡可加重KOA 的病情。因此，有研究认为，阻抑软骨细胞的凋亡可在一定程度上改变KOA 的转归[13-14]。KOA 的发生和发展是一个漫长而缓慢的过程，这也与软骨细胞的凋亡过程不同步有关。大量的实验结果证实，在正常的膝关节软骨组织中，凋亡细胞的检出率很低，且多存在于软骨表面。但在KOA 模型中，软骨表面至中层都存在细胞凋亡的现象。当软骨表面发生纤维化时，这种现象甚至可出现在软骨深层。

近年来，关于软骨细胞凋亡在KOA 中作用的研究越来越多。相关的动物实验[15-16]、人体实验（包含体外和体内实验）[17]结果表明，在发生KOA 的软骨组织中，细胞凋亡的发生率很高。软骨细胞凋亡在KOA 的进展中具有重要的作用。目前，大多数的实验研究均以动物KOA 模型为研究对象。末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记测定法（TUNEL）是目前检测软骨细胞凋亡过程中染色体DNA 断裂的常用方法。

3 预处理KOA 模型对bcl-2 和bax 蛋白表达的影响

软骨细胞过度凋亡是KOA 发生发展过程中出现的一种病理变化过程。bcl-2 和bax 基因是参与软骨细胞凋亡机制的一类相关因子。因此，通过影响bcl-2 和bax 的表达，阻抑软骨细胞的凋亡，阐明预处理在KOA 治疗中的有效性成为近年来临床上研究的重点。具体而言，即运用各种检测bcl-2 和bax 蛋白的手段、预处理方法可明显减少KOA 患者软骨组织中的凋亡细胞。而且，运用检测bcl-2 和bax 蛋白的手段发现bcl-2 的表达增加、bax 的表达降低可在一定程度上阐释预处理在KOA 治疗中的有效性。

邢恩福等[18]将rhil-1 受体拮抗剂注入兔KOA 模型的膝关节腔内，并采用TUNEL 染色法在光镜下观察兔膝关节软骨组织中细胞凋亡的情况，结果显示，与模型组兔相比，实验组兔软骨组织中的凋亡细胞明显减少。该研究结果表明，采用rhil-1 受体拮抗剂对兔KOA 模型进行预处理可降低其软骨细胞的凋亡率。进行Western blot 检测的结果表明，与模型组兔相比，实验组兔软骨组织中bcl-2 蛋白的表达明显增加，bax 蛋白的表达显著降低。进行逆转录- 聚合酶链反应（RT-PCR）检测的结果显示，实验组兔软骨组织中bcl-2 蛋白的信使核糖核酸（mRNA）增强，bax 蛋白的mRNA 减弱。近年来，张媛媛等[19]、张宇标等[20]、胡炯等[21]分别采用电针、甲基莲心碱和染料木素对大鼠KOA 模型进行预处理后发现，与KOA 模型组大鼠相比，实验组大鼠软骨组织中凋亡阻抑蛋白bcl-2 的表达升高，促凋亡蛋白bax的表达降低。此外，中药在减轻KOA 的严重程度中显示出良好的作用。何晓瑾等[22]研究骨痹方对KOA 大鼠软骨细胞结构和功能的影响后发现，该方可促进其软骨组织中Akt和Bcl-2 蛋白的表达，抑制其软骨细胞的凋亡。李成付等[23]对兔KOA 模型软骨组织中bcl-2/bax、Akt 的表达进行研究后发现，牛膝乙醇提取物可有效增加兔软骨组织中bcl-2 和bax 蛋白的表达，阻抑其软骨细胞的凋亡。

4 软骨细胞凋亡与软骨细胞自噬的关系

软骨细胞的死亡可能包括凋亡和自噬两种形式。这两种形式可能存在于KOA 的不同病理阶段。但自噬与凋亡、坏死不同。在软骨细胞发生自噬的早期，其中的染色质可发生无序凝聚，高尔基体和内质网的数量可增加，吞噬小泡和细胞外基质小泡可发生聚集。西班牙拉科鲁纳的研究人员曾表示，增加KOA 患者软骨细胞的自噬水平可防止其软骨组织发生退化[24]。一项关于TUNEL 染色阳性的人骨关节炎软骨细胞的研究表明，高尔基58 K 蛋白和caspase-2l重叠，这一研究结果证实了上述的观点[25]。相关的研究报道表明，bcl-2 可作用于阳性的自噬调节因子beclin-1[26]。这些证据都提示，细胞凋亡与细胞自噬之间存在一定的关联性。这二者之间的关联性也为研究KOA 与软骨细胞凋亡关联性的人员提供了新的研究思路。

5 小结

KOA 的发病机制非常复杂。临床上尚不清楚该病具体的发病机制。目前，对bax 和bcl-2 的研究主要集中在动物实验和细胞实验上。bax 和bcl-2 是两种已明确可参与细胞凋亡信号转导途径的相关因子，可能存在于软骨细胞凋亡的多个信号途径中。现今，关于软骨细胞凋亡信号通路与KOA 发病关系的研究报道较少。今后，相关的研究人员可加强对bax 和bcl-2 蛋白的深入研究，并对各种途径之间的联系进行研究，从而为临床上治疗KOA 提供指导。