杨廷芳，王 丽，史月滨，陆 婷，张 勇

1昆明医科大学，云南昆明 650500；2 昆明医科大学第一附属医院，云南昆明 650032；3 云南省第一人民医院，云南昆明 650032

放射治疗在恶性肿瘤治疗中占据重要地位。尽管放疗技术的不断革新使治疗效果及患者生活质量明显改善，但辐射诱导旁效应(the radiationinduced bystander effect，RIBE)也引起了科研及临床工作者们的重视。截至目前，尚无确切方法防治辐射旁效应。辐射诱导旁效应已成为放射生物学及辐射防护领域的研究热点，研究其调控机制对优化放射治疗、放射防护及辐射安全等具有重要意义。

1 辐射诱导旁效应概述

辐射诱导旁效应指受辐射细胞或组织释放的信号导致未受辐射的机体其他部位发生的生物学现象，包括基因组不稳定、应激反应、凋亡及细胞增殖改变等生物学反应[1-2]。

关于RIBE 的报道可追溯到1954 年，Parsons等[3]发现慢性粒细胞性白血病患者的脾经X 线照射后，胸骨骨髓中检测到导致染色体结构损伤的因子——致裂因子。1992 年Nagasawa 和Little[4]发现当0.1%～1% 中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells，CHO)受α 粒子照射时，30%～50%的细胞出现姐妹染色单体交换，表明射线诱发了辐射旁效应。此研究开启了以细胞模型研究辐射诱导旁效应的先例，也引起了研究者们对辐射旁效应的高度重视。此后，研究者们在大多数细胞中观察到了辐射诱导旁效应[5]。临床研究也发现肿瘤放射治疗后可引起正常组织的损伤，常见的有肺癌放疗所致放射性肺炎和放射性肺纤维化[6]。

辐射旁效应是保护因素还是有害因素曾一度引发争议。实验证据已将RIBE 与癌症的许多特征联系起来，包括基因组不稳定、细胞能量失调、抵抗细胞死亡、肿瘤免疫逃避、肿瘤促进炎症以及增强的放射抵抗，突出了RIBE 事件在患者治疗中的不良反应作用[7]。但近期有研究又重新确立了RIBE 在放射治疗中对转移瘤的杀伤作用。Tubin等[8]回顾分析了23 例接受非传统立体定向放射治疗(stereotactic body radiation therapy，SBRT) 的不可切除的大体积肿瘤病例，对肿瘤的低氧节段(SBRT-PATHY)利用非靶向效应进行放射治疗，发现RIBE 响应率为96%。放射治疗4 周后，肿瘤体积缩小的中位值为70%，17%的研究对象完全缓解，且未出现任何急性或迟发毒性反应。表明SBRT-PATHY 在利用辐射缺氧诱导的非靶向效应在治疗肿瘤方面起到了显著作用。但受限于样本量，缺乏前瞻性研究的证实。近年Farias 等[9]开发了新模型，使用人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)和射线照射同时干预异体肿瘤移植小鼠模型，发现协同机制的存在。这种机制能够增强辐射杀灭原发肿瘤及转移灶的局部和全身性反应，表明了辐射诱导旁效应在杀灭肿瘤转移灶中有其作用。有研究者建立外泌体联合放射治疗的模型，研究辐射诱导旁效应。De Araujo Farias等[10]发现人脐带间充质干细胞产生的外泌体联合放射治疗，可抑制转移性黑色素瘤细胞的扩散，表明外泌体联合放射治疗参与了辐射诱导旁效应，该研究将放射治疗的局部治疗作用拓展到全身疗效上，开拓了转移性肿瘤的治疗思路。

2 辐射诱导旁效应机制研究

早期研究认为辐射旁效应的机制主要是通过细胞间缝隙连接(gap junction intercellular communication，GJIC)和活化生化信号分子两条途径传递信号[11-12]。近年来，越来越多的证据表明外泌体是介导辐射诱导旁效应机制的一条重要途径[13-15]。

2.1GJIC 研究表明GJIC 是由连接蛋白Connexin形成的簇状细胞管道结构，在相邻细胞之间的信号传递和物质交换中起重要作用，而连接蛋白存在于人类所有类型的解剖组织中[16]。RIBE 可以通过GJIC 将辐照细胞释放的损伤信号传递给未受射线照射的旁细胞，从而引起旁细胞的损伤改变。Autsavapromporn 等[11]发现细胞在质子和重离子照射时产生的信号通过细胞间缝隙连接可损伤旁细胞，这种损伤效应可以传给其子代细胞，子代旁细胞的应激效应水平取决于线性能量传递(linear energy transfer，LET)的特性。GJIC 抑制剂可减轻高LET 射线(质子或碳离子)对旁细胞后代的氧化损伤和基因损伤，但不能减轻低LET 射线(X 射线)对旁细胞后代的损伤作用。此外，Arora 等[17]使用肺癌细胞系和卵巢癌细胞系研究顺铂通过GJIC 诱导旁细胞发生毒性损伤时，发现顺铂对旁细胞的损伤作用是由癌细胞密度决定的。只有在高密度缝隙连接结构形成，靶向抑制连接蛋白43(connexin43，Cx43)时，旁细胞不发生毒性损伤反应，从而表现为癌细胞对顺铂耐药。表明GJIC 有增强顺铂对旁细胞毒性损伤的作用，且与连接蛋白的密度呈正相关关系。上述研究证实GJIC 是RIBE 的机制之一，GJIC 通过连接蛋白介导RIBE。

2.2活化生化信号分子及相关通路 研究发现肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGFβ)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、一氧化氮(NO)及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) 通路参与RIBE[18-20]。Widel 等[21]用X 线照射野生型和TP53 基因敲除的人结直肠癌细胞HCT116，然后与未受照射共培养，IL-6 和IL-8 参与RIBE。Sergeeva 等[19]发现ROS 和超氧化物自由基(superoxide radical production，NOX)参与RIBE。Fu 等[20]发现经α 粒子照射后，MAPK通路和NF-κ 通路协同作用调节巨噬细胞释放TNF-α 和IL-8，在RIBE 中促进旁细胞损伤。Fu等[22]发现在受辐照细胞中，RIBE 分子机制依赖于p53 活化及相关凋亡通路，局部照射后辐射诱导旁效应及巨噬细胞介导的辐射诱导旁效应是局部照射后常见的淋巴细胞减少的原因之一。已知半胱氨酸蛋白酶CPR4(一种同源的人组织蛋白酶B)为线虫的首个辐射诱导旁效应因子。Peng 等[1]发现受紫外线或γ 射线照射的秀丽隐杆线虫分泌的CPR-4，降低了紫外线剂量依赖性动物的生殖细胞死亡率，也增加了未受辐射的动物胚胎死亡率，导致了辐射组织远隔的未受照射组织损伤，他们推测CPR-4 是通过胰岛素样生长因子受体DAF-2 发挥辐射诱导旁效应作用，此研究为辐射诱导旁效应作用机制提供了新思路。上述研究通过体内外实验，证实了活化生化信号分子及相关通路是RIBE 产生的重要信号传递途径，深入研究活化生化信号分子及相关通路在RIBE 中的作用，可为揭示RIBE 的产生机制及其防治提供理论依据。

2.3外泌体 近年来，研究表明外泌体也参与辐射旁效应[23]。众多研究已通过外泌体内含物，包括DNA、miRNA 及蛋白层面，研究外泌体在RIBE 中的作用。陈纤等[24]用X 线照射H460 非小细胞肺癌细胞，采用差速离心法提取外泌体处理旁细胞，发现旁细胞的微核形成率增加，这种现象在用RNA 酶处理外泌体后消失，受照射H460 细胞分泌的外泌体可能是介导电离辐射旁效应的机制之一，外泌体RNA 可能是介导电离辐射诱导旁效应的一种重要信号分子，并推测外泌体可能通过膜融合的方式进入旁细胞。Ariyoshi 等[13]用4 Gy X 线分别照射细胞条件培养基(irradiated cell conditioned medium，ICCM) 及小鼠血清，然后提取对应的外泌体样囊泡(exosome-like，ELV)处理正常人成纤维细胞，发现处理后的细胞均出现DNA 损伤，进一步用DNA 酶、RNA 酶和蛋白酶处理从条件培养基中提取的外泌体囊泡(ICCM ELV)，证实辐射诱导旁效应是由外泌体样囊泡中的线粒体DNA 介导的。外泌体来源的miRNA 亦被证实在RIBE 中起重要作用，包括在放射治疗后激活辐射旁效应并引起基因组不稳定[15]。宋曼[25]用射线照射人支气管上皮BEP2D 细胞，发现辐射诱导的外泌体miR-1246 通过条件培养基促进未照射细胞微核的产生和DNA 损伤相关蛋白53BP1 聚焦点(foci)的形成，产生旁基因组损伤效应，证实了外泌体miRNA 参与RIBE。Tan 等[26]采用两种细胞系共培养的方法，首次发现分别与α 粒子、X 线照射的皮肤角质HaCaT 细胞共培养后，未受辐射的WS1 细胞迁移受到抑制，进而发现内含miR-27a 的外泌体是主要的RIBE 信号因子；再用含miR-27a 的外泌体处理未受辐射的WS1 细胞，发现升高的miR-27a 根据细胞内的氧化还原状态通过MMP2 抑制旁效应细胞迁移，证实外泌体miRNA 是介导RIBE 的重要调节因子。此外，外泌体来源的蛋白质也参与RIBE。Freudenmann 等[14]发现癌细胞通过外泌体分泌的L-Plastin 蛋白促进癌细胞克隆形成和有丝分裂活性增加，肿瘤细胞经辐射后产生的生长抑制因子减少；进一步通过免疫沉淀及siRNA 敲低L-Plastin 蛋白表达后，推断RIBE 是由辐射触发的有丝分裂活性或克隆形成降低所致。Mo 等[27]分别于正常氧含量和缺氧条件下，照射非小细胞肺癌A549 细胞，然后提取外泌体与未受辐射的A549 细胞或人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)共培养，发现外泌体明显促进了A549 细胞增殖、迁移和侵袭，促进HUVEC 增殖和血管新生。缺氧细胞和辐照细胞释放的外泌体较正常细胞释放的外泌体促进肿瘤进展的作用更强。发现外泌体内的血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4) 可促进A549 细胞迁移和HUVEC血管新生。近期Dong 等[28]发现内质网和线粒体等细胞器也参与RIBE，该研究是对外泌体等囊泡参与RIBE 机制研究的拓展。

3 细胞自噬与辐射诱导旁效应

3.1细胞自噬 细胞自噬，又称Ⅱ型程序性细胞死亡，指细胞受刺激时利用溶酶体消化回收废弃的细胞成分和细胞器以实现对自身代谢和能量的更新[29]。细胞自噬是真核细胞的一种自我保护机制，在维持细胞稳态、能量代谢及应对应激等方面起着重要的作用[30]。哺乳动物的细胞自噬分为三类：大自噬/小自噬和分子伴侣介导的自噬[31]。目前认为细胞自噬起到抑制肿瘤发生的作用，但在肿瘤发展的进程中起促进作用[32-33]。

3.2GJIC 参与RIBE 细胞自噬 范华东[34]采用体外质粒转染实验研究细胞自噬在α 粒子辐射旁效应中的作用，发现不同剂量α 粒子辐射细胞产生的不同水平ROS，在细胞间缝隙连接途径诱导旁区细胞自噬中起关键作用。作为细胞间缝隙连接的关键组成分子及细胞自噬系统底物的Cx43，介导照射区细胞产生的ROS 向旁细胞传递[35]。低剂量(10 cGy)、高剂量(300 cGy)α 粒子辐照细胞产生ROS，一方面通过GJIC 分别引起旁细胞自噬的激活和抑制；另一方面ROS 分别激活和抑制酪氨酸激酶Src，引起旁细胞自噬的激活和抑制。此研究可为肿瘤放射治疗保护非靶器官提供实验依据。

研究表明ROS 是细胞氧化还原的下游调控靶点。Yang 等[36]在经α 粒子照射的肝癌细胞HepG2中发现活化的酪氨酸激酶Src 使Cx43 265 位点酪氨酸磷酸化，抑制辐照细胞的Cx43 磷酸化水平后，发现旁细胞中DNA 损伤蛋白γ-H2A 焦点形成率显著增加；他们进一步证实了自噬调控Src 活性和Cx43 磷酸化，并且旁细胞自噬水平与辐射诱导的ROS 相关。此研究为ROS 和自噬通过调控Src-Cx43 通路介导GJIC 参与RIBE 自噬提供了依据。吴李君[37]用50 cGy α 粒子照射HepG2 细胞后，也证实了自噬途径通过调节Src 激酶活性参与Cx43 的磷酸化，而Cx43 第265 位的磷酸化是影响RIBE 的重要途径。上述两项研究的结果与范华东的研究相符，证实α 粒子诱发的ROS 通过GJIC调控旁细胞自噬。

3.3活性生化信号分子参与RIBE 细胞自噬 电离辐射可通过释放促进肿瘤进展的衰老相关分泌因子(senescence-associated secretory phenotypes，SASps)诱导未受照射的旁细胞产生有害的辐射诱导旁效应。Huang 等[38]发现细胞自噬是辐射诱导垂体瘤转化基因1(pituitary tumor transforming gene1，PTTG1)缺陷的乳腺癌细胞发生衰老的必要条件，抑制自噬可使细胞由X 线辐射诱导的衰老状态转变为凋亡；衰老的癌细胞通过释放CSF2 激活JAK2-STAT3 和AKT 通路，促进未受辐射细胞发生侵袭和迁移而发挥辐射诱导旁效应。此研究首次揭示了自噬在辐射诱导衰老和旁效应中的双重作用。

Wang 等[39]采用3 Gy γ 射线照射人肝癌细胞HepG2，收集条件培养基(conditioned medium，CM)处理非辐射细胞，并检测到伴随细胞内ROS 增加的线粒体功能障碍(线粒体膜蛋白MMP)，微核和自噬蛋白标志物表达量升高；1% 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO) 加入到CM 后，旁细胞的微核数量及自噬蛋白标志物含量显著降低，辐射旁细胞转染自噬相关蛋白LC3 siRNA 或Beclin-1 siRNA 后，旁细胞的微核数量显著增加。此研究证实了ROS 参与RIBE 细胞自噬。Kong 等[40]发现用X 线照射海拉细胞，未受照射的旁细胞(unirradiated cell，UIC)，特别是具有预诱导自噬的UIC，可以分泌IL-6，并且证实自噬可以激活自噬过程中产生IL-6 所需的信号转导和转录激活因子3(the signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)。得出RIBE 的代谢协同作用很可能是由受辐照的细胞释放的旁观者因子启动，诱导UIC发生自噬并激活STAT3 产生IL-6，最终表现为UIC 分泌的IL-6 激活UIC 中NF-κB 通路的结论。

3.4外泌体参与RIBE 细胞自噬 外泌体作为一条额外的通路在RIBE 细胞间通讯中起着重要作用[15]。Song 等[41]用2 Gy γ 射线照射人支气管上皮BEP2D 细胞，发现外泌体中的microRNA-7-5p 可通过EGFR/Akt/mTOR 信号通路介导辐射旁细胞发生自噬，这种外泌体介导的自噬可以被microRNA-7-5p 抑制剂抑制，证实外泌体参与RIBE细胞自噬。Cai 等[42]经10 Gy X 线照射小鼠大脑后，从星形胶质细胞中提取外泌体并染色，然后分别加入未照射星形胶质细胞及经尾静脉注射到自噬双标LC3B-GFP 小鼠体内，检测到未受照射的细胞及小鼠肺组织中microRNA-7 水平升高而凋亡蛋白Bcl-2 水平降低，接着用双荧光素酶报告基因检测证实microRNA-7 直接靶向Bcl-2，证实了外泌体microRNA-7 靶向Bcl-2 介导局灶性脑照射后肺内旁观者自噬。该研究从体内和体外实验证实了外泌体介导辐射旁自噬。

4 问题与展望

目前RIBE 的机制研究主要集中于细胞间缝隙连接、活性生化信号分子及外泌体三条途径。近年来研究发现细胞自噬存在于RIBE 中，是旁效应细胞的一种反应，但对于其在RIBE 中作用的研究很少。目前常用的自噬检测方法，如电镜观察自噬体和溶酶体的超微结构、生化检测自噬体膜标志蛋白及自噬底物、免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3 或GFP-LC3 斑点形成等，特异性及准确性欠佳，增加了对自噬的功能评估难度，也限制了其研究进展。Tian 等[43]开发了一种有效检测哺乳动物自噬的单克隆抗体，今后会有更多高效准确的自噬检测方法出现。近年来，外泌体在RIBE 中的研究越来越多，涉及外泌体miRNA、线粒体DNA 及蛋白质等层面。已有研究发现外泌体介导旁区细胞自噬。进一步研究细胞的自噬系统及外泌体如何协同作用参与旁细胞自噬，将有助于揭示RIBE 的机制。此外，当辐射剂量超过一定阈值时，辐射诱导旁效应不再增加，这是否与分布在细胞膜上的细胞间缝隙连接的组成分子的数量和密度有关?不同剂量率对自噬在辐射旁效应的影响及时间-效应机制也尚不清楚。同时，目前的研究主要为细胞水平和动物模型研究，人体研究还有很远的路要走。

虽然辐射诱导旁效应是一种弱生物效应，但其增加了放射治疗及辐射防护的复杂性。在我国，65%～75%的肿瘤患者在治疗过程中接受过放射治疗，所以深入研究细胞自噬有助于进一步探索RIBE 的产生机制，既可增强放疗对肿瘤细胞的杀伤效应，又能减轻RIBE 对正常组织器官的损伤，有望发掘临床精准放疗和防治辐射旁效应的新靶点。相信随着机制研究的深入及放疗技术的发展，可早期干预RIBE，同时又能提高放射治疗疗效的临床实践会越来越多。

利益冲突：无。

作者贡献声明：杨廷芳负责构思和撰写论文；史月滨、陆婷负责校对；张勇、王丽负责修改论文和基金支持。