张冠怡，姚冬婷，王 健，胡晓波

（1.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032；2.上海市临床检验中心，上海 200126）

一项侵袭性真菌感染调查结果显示，光滑念珠菌已成为致病率最高的非白念珠菌，常在免疫力低下和肠外营养支持器官移植的患者中检出[1]。我国临床感染疾病调查发现，光滑念珠菌感染居非白念珠菌感染的第3位，且对氟康唑和伏立康唑具有交叉抗性[2]。随着抗菌药物的广泛和长期使用，非白念珠菌对单一药物的耐药率和交叉耐药率逐年增高，曾经使用过抗菌药物和免疫抑制剂的患者对抗真菌药物更容易产生耐药。

目前，光滑念珠菌感染的治疗药物主要包括唑类、多烯类（主要是两性霉素B）、氟胞嘧啶和棘白霉素类（米卡芬净、卡泊芬净等）。唑类药物具有价格低、耐受性好、便于使用等优点，是临床常用的抗真菌药物，但在单独使用时，光滑念珠菌常表现为对唑类药物耐药[3]，尤其对氟康唑的耐药性最为普遍[4]。光滑念珠菌对唑类药物的交叉耐药也很普遍，特别是氟康唑和伏立康唑联合用药[2]。唑类药物联合他汀类药物对光滑念珠菌具有抑制作用。但有研究发现，他汀类药物可以抑制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A，但具有肝毒性，不宜与唑类药物联合使用[5]。棘白霉素类药物对耐唑类药物菌株具有良好的抑菌效果，光滑念珠菌对棘白霉素类抗菌药物的耐药率<1%[6]，常用于治疗危重患者，但因成本较高，在临床治疗中的应用相对较少。两性霉素B和氟胞嘧啶联合用药对光滑念珠菌的治疗具有协同作用，但两性霉素B对肾功能具有一定的损伤，不建议使用[3]。为解决耐药问题，临床联合运用中西药治疗光滑念珠菌，为光滑念珠菌感染的临床治疗提供了新的途径。本文对光滑念珠菌的耐药机制及中西药治疗光滑念珠菌感染的研究进展进行综述，以期为临床治疗光滑念珠菌感染提供参考。

1 光滑念珠菌耐药机制

1.1 药物外排作用

药物外排作用是光滑念珠菌耐药机制之一。已进入细胞内的药物通过外排泵被排出细胞外，使细胞内的药物浓度降低，不能对光滑念珠菌生长起到抑制作用。外排泵相关蛋白主要是ABC转运蛋白，相关基因包括CYP51A、CYP51B、CDR1、CDR2、MDR1、MDR2、Yapl、shol等。PDR亚家族成员作为半转运蛋白，是编码ABC转运蛋白的主要蛋白，在光滑念珠菌中普遍存在，包括CgCDR1、CgCDR2、CgSNQ2、CgAUS1等7个亚成员[7]。外排基因过表达使得蛋白转运功能增强，从而使药物被转运到细胞外。黄金梅等[8]发现，大部分的光滑念珠菌为剂量依赖型，将其诱导为耐药菌株后，药物外排相关基因（CDR1、CDR2、MDR1、MDR2、Yap1、Shol等）在耐药株中的表达明显高于野生株。张朋等[9]运用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测到氟康唑和他克莫司联合使用时，CDR1的表达大大增加，通过荧光定量PCR检测到二乙酰基荧光素外排升高的幅度最低，具有协同作用，抑制了氟康唑单独使用时菌株的耐药性。刘锦燕等[10]经过30轮体外诱导，使敏感菌株成为耐药菌株，采用逆转录PCR检测到耐药菌株CDR1、CDR2、PDR1基因表达明显高于敏感菌株，PDR1基因中W297S、F575L、P822L、P927L的氨基酸置换导致了CDR1、CDR2、PDR1基因表达的增加。SHAHROKHI等[11]运用RT-PCR在大部分剂量依赖型光滑念珠菌中检测到由CDR1和CDR2基因编码的质膜蛋白cdr1p、cdr2p，这些蛋白是氟康唑抗性的重要因子，进一步证明了CDR1和CDR2基因的表达水平对氟康唑耐药的影响。

线粒体基因组的状态丧失、唑类药物的攻击和转录调节子（RPN4和HAP1）的调控，都可以影响PDR1蛋白的表达[12]。GOHAR等[13]发现耐药光滑念珠菌PDR1基因中含有6个功能获得性突变（有6个氨基酸被取代），其中W279R和T588A氨基酸代替与CDR1和CDR2过表达有关；他们还发现了3个新的氨基酸突变，其中P915R与SNQ2过表达有关。但CDR1、CDR2和SNQ2不会同时表达，且SNQ2表达的变异最高。CgPDR1蛋白表达会改变外排泵功能，CgPDR16基因的缺失会使光滑念珠菌产生应激反应。CgPDR16基因缺失菌株中PDR1、CDR1、CDR2基因表达降低，从而使菌株多药耐药性减弱，并增强了对唑类药物的敏感性，即使删除所有与外排泵相关的基因，PDR16基因的缺失还是会使菌株对唑类药物的敏感性增强[14]，使CgPDR16p成为降低菌株多药耐药最有希望的靶标，而且可由氟康唑诱导表达，反映了光滑念珠菌基因的可塑性。

1.2 生物膜的形成

光滑念珠菌生物膜的形成是其致病和耐药的主要因素。生物膜表面的黏附性使菌株可定植于生物表面或导管等物品表面，形成菌膜，导致机体感染。唑类药物可诱导生物膜相关基因表达，生物膜相关基因过表达和突变可使生物膜的黏附性或疏水性增强，从而增加感染的概率[15]。生物膜形成的单层致密结构，包括蛋白质、麦角甾醇等结构，阻碍了唑类药物进入细胞基质，从而导致耐药[16]。

麦角甾醇是真菌生物膜的主要成分，ERG11编码的14α-去甲基酶（细胞色素p450酶）是麦角甾醇合成的关键酶，唑类药物通过抑制ERG11基因来影响麦角甾醇的合成。UPC2是ERG11的转录调节因子，受ERG11基因的调控，包括UPC2a和UPC2p[17]。有学者[18]发现Upc2a作为启动子，既可与PDR1、CDR1结合，又可转录调节与ERG11结合，耐唑类药物的光滑念珠菌存在Upc2a的缺失，PDR1表达下调，从而导致菌株耐药。江岑等[19]发现耐药念珠菌中ERG11过表达是由转录调控因子Upc2p的获得性功能突变引起的；WHALEY等[17]发现Upc2A可以调节Erg11的甾醇生物合成途径酶的表达，影响ERG11基因的表达，从而产生耐药。

ERG3基因（C-5甾醇去饱和酶）编码参与麦角甾醇生物合成的蛋白，基因中特别的突变点可以改变唑类药物的抗真菌有效性[20]。有学者[21]从糖尿病患者、肾移植患者和对照者中分离出光滑念珠菌，通过ERG3基因的点突变可以阻碍唑类药物的药效，ERG3基因突变属于功能丧失性突变，包括纯合子（A138T、P181A）和杂合子（P267S），而且纯合子突变比杂合子突变会使最小抑菌浓度值增高更加明显。

甘露聚糖和β-葡聚糖是光滑念珠菌细胞壁的主要成分，存在于生物膜外的基质中，细胞外基质（甘露聚糖和葡聚糖复合物）对抗真菌药物具有隔离作用，可以增强光滑念珠菌耐药性。DOMINGUEZ等[22]检测了氟康唑对10株菌株的抑菌情况，发现氟康唑抑菌率均未达到50%，通过追踪放射性标记，发现氟康唑大部分停留在细胞外基质中；使用甘露聚糖酶和葡聚糖酶裂解细胞，再用氟康唑检测菌株敏感性，发现生物膜负荷显著下降，且使用甘露聚糖比使用葡聚糖效果更加明显，证明了甘露聚糖和β-葡聚糖对真菌耐药性的影响。

FKS基因与β-葡聚糖合成有关，FKS基因突变会调节葡聚糖的合成，使得细胞膜稳定性增强；FKS基因的过表达可使生物膜的黏附性增强，从而产生耐药。耐药光滑念珠菌中存在FKS基因的改变，光滑念珠菌FKS基因包括FKS1和FKS2。有研究采用新的测序方法发现多重耐药光滑念珠菌FKS1、FKS2和GSC1热点区域存在54个错义突变，包括K1323E和F625S突变点[23]。BOURGEOIS等[24]发现FKS2基因突变与光滑念珠菌的耐药有关，且不同突变位点导致的耐药水平不同

1.3 其他耐药机制

学者们对光滑念珠菌耐药机制的研究还涉及呼吸缺陷、宿主免疫反应等方面。有研究通过观察线粒体的膜电位发现耐药光滑念珠菌存在线粒体呼吸缺陷，加入呼吸抑制剂NaN3可以抑制经典呼吸复合物Ⅳ，使敏感菌株的平均荧光强度略强于耐药菌株，证明了耐药菌株存在呼吸缺陷[19]。

免疫逃逸是真菌耐药的另一个途径，可使真菌逃避药物治疗的宿主免疫应答反应。光滑念珠菌侵入人体时可以激发身体的固有免疫和适应性免疫途径，先天免疫识别可以使抗原呈递细胞具有触发T细胞分化的能力，从而驱动辅助性T细胞依赖的适应性免疫应答。宿主先天免疫细胞在遇到病原体时可以分泌几种细胞因子，从而导致辅助性T细胞分化。炎症细胞因子包括肿瘤细胞因子α、白细胞介素6、白细胞介素1b和白细胞介素12p40等。Dectin-1和Dectin-2为C型凝集素受体，介导辅助性T细胞1和辅助性T细胞17的适应性免疫应答途径。有研究采用免疫印迹法对缺乏Dectin-1和Dectin-2，且腹膜感染光滑念珠菌的雌鼠的巨噬细胞和中性粒细胞蛋白进行提取、测定和分析，发现Dectin-1使宿主对光滑念珠菌入侵具有更高的敏感性；且Dectin-1缺陷型中性粒细胞的杀伤能力明显受损，而Dectin-2缺陷型中性粒细胞的杀伤能力与野生型中性粒细胞相似[25]。提示Dectin-1是检测光滑念珠菌感染的宿主巨噬细胞所必需的，而Dectin-2对感染光滑念珠菌的影响属于剂量依赖型。

2 中药在光滑念珠菌感染治疗中的应用

中药与唑类药物相比，具有不良反应少、耐药性弱及预后良好的优点，在临床抗真菌治疗中多与唑类药物联合使用。中西药联用对耐药念珠菌感染提供了有效的治疗途径。中药对治疗真菌深部感染具有显著的效果，常被用于治疗呼吸系统、泌尿系统、血液系统等[26]的真菌感染。

有研究结果表明，牡丹皮、地骨皮、胡黄连、番泻叶、白头翁、大蒜、轻粉和细辛等中药材可对真菌感染起到不同程度的抑制作用；牡丹皮、地骨皮、胡黄连和白头翁具有不同程度的清热、祛湿的功效，大蒜和轻粉具有解毒、杀虫的功效，细辛具有解表散寒、祛风止痛的功效；中医临床治疗中，上述中药常被用于治疗有湿热下注、痰热壅肺等证型的念珠菌病，可达到辨证治疗和抑菌的效果[27]。

在临床治疗中，中药或中药中的单体成分均对光滑念珠菌具有抑菌作用。龚倩玉等[28]发现，杜仲中提取的异色酮对光滑念珠菌具有中等抑菌作用。有学者[5]通过动力学抑制反应发现，从中药材中提取的α-细辛醚衍生物对CgHMGR合成的抑制作用最为显著，α-细辛醚衍生物的硝基、甲氧基和乙酸酯部分与酶活性区域的残基相互作用，是潜在的药效团；他们通过测试毛状线虫的生长状况，发现α-细辛醚衍生物参与了麦角甾醇的合成，主要是通过抑制麦角甾醇的合成发挥其抑菌作用；体外药物敏感性试验结果也证明了对氟康唑耐药的光滑念珠菌对α-细辛醚衍生物同样具有敏感性。张梦翔等[29]通过观察姜黄素对光滑念珠菌菌丝和生物膜形成的影响，发现姜黄素可抑制光滑念珠菌的生长，从而发挥抑菌作用。汪天明等[30]通过观察黄连解毒汤的乙酸乙酯提取物对光滑念珠菌黏附的影响，发现黄连解毒汤乙酸乙酯提取物可下调黏附相关基因的表达，从而影响光滑念珠菌的黏附作用，进而达到抑菌效果。

中药治疗念珠菌感染的效果显著，且中药种类繁多，主要以清热燥湿、杀虫止痒为主，佐以补虚中药，在辨证论治的同时可以达到抑菌的效果。

3 中药联合唑类药物对光滑念珠菌的抑菌作用

中药联合唑类药物治疗念珠菌感染效果更好，且安全性更高，为解决念珠菌耐药问题提供了新的途径。谭妙群等[31]通过对阴道念珠菌反复感染患者的临床观察发现，伊曲康唑和苦参汤外洗联合使用比单独使用伊曲康唑的治疗有效率更高，恢复时间更短，不良反应发生率更低，并可减少疾病复发。王福君[32]、刘宁[33]和林喜娟[34]使用含有苦参等成分的中药洗剂联合唑类药物治疗阴道念珠菌感染，也得到相同的治疗效果。杨坤等[35]通过对老年口腔念珠菌病患者的临床观察发现，氟康唑联合黄芩等清热燥湿的中药，比单独使用氟康唑的治疗效果更好，且治疗过程中不适反应较少，老年人更易接受。

有研究发现，八角茴香油、丁香挥发油、大蒜素、黄芩苷、小檗碱、类黄酮等中药单体与氟康唑联合使用对光滑念珠菌的抑制作用显著[36]。王维欣等[37-38]发现黄连素和没食子酸对光滑念珠菌的抑菌效果也很显著，黄连素单独使用抑菌效果最明显，与氟康唑联用表现为无关作用；而没食子酸与氟康唑联用具有协同作用，且没食子酸浓度越高，两药的协同效果越显著；他们通过绘制时间-杀菌曲线发现，没食子酸单独用药不能起到抑菌作用，氟康唑单独用药可以抑菌，但效果弱于联合用药，证实了没食子酸和氟康唑联用具有协同效果；他们在不同时间段通过测定492 mm波长下不同菌株的吸光度值以判断菌株的黏附性，发现100 mg/mL没食子酸和氟康唑联用，可在2 h内对光滑念珠菌的早期黏附性起显著抑制作用，提示没食子酸抑菌的主要机制是抑制生物膜形成的早期黏附性。吴盘红[39]发现黄连煎剂联合唑类药物对光滑念珠菌具有一定的抑菌作用，联合用药的FICI<1，黄连素与唑类药物联合使用对抑制光滑念珠菌感染具有协同作用。

中药单体与唑类药物联合使用对抑制光滑念珠菌感染具有一定的协同和加强作用，中西药联用可降低光滑念珠菌获得性耐药，使免疫功能低下的患者更耐受，且副作用小，为临床治疗提供了有效的途径。

4 总结

唑类药物是目前临床治疗真菌感染的主要药物，光滑念珠菌对氟康唑的耐药率最高，主要机制是光滑念珠菌对药物的外排作用。氟康唑可诱导外排泵基因的表达，主要由ABC转运蛋白及相关基因调节。功能性突变是导致光滑念珠菌对唑类药物耐药的主要机制，但也不能排除非功能性突变的影响。UPC2、ERG3等新的耐药基因的发现可帮助学者们深入研究生物膜对耐药机制的影响。临床抗真菌治疗中，中药具有副作用和耐药率低的优点，与唑类药物联用可以减少耐药，加强抑菌作用，具有较好的辅助作用。中西药联用治疗念珠菌感染为临床解决耐药问题提供了新的途径。