王涛，韩玉，潘力，王冰，孙茂文，王翌，罗玉子，仇华吉，孙元

针对非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因的TaqMan荧光定量PCR的建立

王涛，韩玉，潘力，王冰，孙茂文，王翌，罗玉子，仇华吉，孙元

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150069

【】建立一种以MGF360-13L基因为靶标的实时荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）的方法，为非洲猪瘟（African swine fever, ASF）的诊断、基因缺失毒株鉴别、病毒分离鉴定、基因功能研究提供技术支持。首先，以ASFV中国流行毒株（GenBank: MK333180.1）的基因序列为靶标设计并筛选了1对特异性引物和探针，建立其荧光定量PCR检测方法。设计引物13L-F/13L-R，扩增，并将其克隆至pOK12载体，挑取阳性克隆并测序验证，构建重组质粒标准品。将重组质粒标准品连续10倍梯度稀释，以稀释后的各梯度质粒标准品为模板，配制反应体系和设置反应条件后进行荧光定量PCR检测，建立标准曲线，并对其敏感性和重复性进行评价；其次，以连续10倍梯度稀释的重组质粒标准品为模板，利用引物13L-F/13L-R进行常规PCR检测，以比较荧光定量PCR的敏感性。最后，运用本检测方法和本研究组已建立的针对ASFV的荧光定量PCR检测方法同时对黑龙江某猪场发生ASF时采集的30份临床样品进行检测，以比较两种检测方法的符合率。另外，应用该方法对感染原代巨噬细胞的ASFV野毒株和MGF基因缺失毒株进行鉴别检测。利用引物13L-F/13L-R可扩增出一条800 bp左右的特异性目的条带，而阴性对照无条带，成功构建出标准品。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法在质粒标……