杜 虹，王晓艳，李 璟，姜 泓，申焕君，王平忠

汉滩病毒（hantaan virus,HTNV）是布尼亚病毒科汉坦病毒属中的一种主要血清型，可引起以发热、休克、出血和肾脏损害为主要临床特征的肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）[1]。HTNV主要感染血管内皮细胞，可引起血管渗漏和通透性增加[2]，但其机制尚不清楚。

多糖包被（glycocalyx,GCX）是内皮细胞屏障结构的重要组成部分，在维持血管内皮完整性方面发挥重要作用[3]。研究发现，在感染或致炎因素作用下，细胞中某些酶（统称为“脱落酶”）的表达或活性增加，它们可分解GCX，致GCX损伤，并释放其组成成分[4]。保护或修复损伤的GCX对防止血管渗漏具有重要作用，可能成为潜在的治疗靶点。然而，HTNV感染是否诱导血管内皮细胞GCX损伤，其机制如何，目前尚不清楚。为此，本研究以HTNV感染的人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vascular endothelial cells,HUVECs）为模型，以GCX为切入点，应用ELISA、间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay,IFA）、Western blot、实时定量PCR等技术，探讨HTNV感染诱导血管内皮细胞GCX的损伤及其初步机制，为HFRS发病机制和治疗靶点的研究提供新的资料。

1 材料与方法

1.1 材料 VERO E6、HUVECs和HTNV 76-118株（HTNV 76-118，以下简称HTNV）均由本实验室保存。VERO E6使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，HUVECs使用内皮细胞专用培养基（ScienCell,1001），培养条件为37 ℃ 5%CO2。硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）、硫酸软骨素（chondroitin sulfate,CS）、透明质酸（haluronic acid,HA）、可溶性CD138和磷脂酰肌醇聚糖的ELISA试剂盒均购自上海西唐生物科技有限公司。一抗抗体均购自abcam公司。

1.2 ELISA检测 应用HTNV感染HUVECs，收取不同感染时间点（0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h）细胞上清进行ELISA检测。每一时间点，HS、CS、HA、可溶性CD138和磷脂酰肌醇聚糖均测定2次，取均值。以血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）和TNF-α刺激作为阳性对照，NC作为阴性对照。……