刘 真,杨志玲,刘晓艳

随着社会经济的发展,如高血压及高血压性心脏病、急性心肌梗死、心肌炎等各种心血管疾病的发病率逐渐升高,成为影响人们身体健康和生活质量的“杀手”,其从发生、发展到一定阶段的共同病理改变是心肌纤维化,心肌纤维化又是心室重构的主要表现之一,心室重构和心肌纤维化主要是由于心肌成纤维细胞过度增殖及分泌胶原纤维功能增强所致,心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)从体积上仅占整个心脏体积的25%,但从其数目上却占正常心肌组织细胞总数的60%～70%,由此可见,成纤维细胞对于心脏稳态的维持有着重要作用[1]。因此,研究心肌成纤维细胞对于现代心血管疾病的研究也具有重要意义。本研究探讨新生SD 大鼠心肌成纤维细胞的原代培养方法。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 出生后48 h 以内的健康SD 大鼠10 只,雌雄相混,SPF 级,由河北医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要实验试剂 D-Hanks 液(Solarbio),胰蛋白酶(含EDTA,Gibco),胎牛血清(FCS,四季青浙江天杭生物技术有限公司),DME/F-12(HyClone),P/S 双抗青链霉素(Gibco),兔抗波形蛋白单克隆抗体(abcam),羊抗兔IgG(Solarbio),DAB 浓缩型试剂盒(Solarbio),5%BSA 封闭液(Solarbio)。

1.1.3 实验仪器 CO2恒温培养箱(力康生物医疗科技控股有限公司),超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),低速离心机(金城国胜实验仪器厂),倒置生物显微镜(LEICA DMI3000 B),光学显微镜(LEICA),冰箱(青岛海尔股份有限公司),干燥箱、雪花制冰机及高压蒸汽灭菌锅均为松下电器。

1.2 实验方法

1.2.1 成纤维细胞原代培养方法[2]用含75%乙醇消毒新生SD 乳鼠表面皮肤,约30 s 后用无菌干棉球将其表皮擦拭干净,于超净工作台中用组织镊撕开乳鼠心脏处表层皮肤,立即用无菌眼科剪紧贴乳鼠胸骨剑突左缘向上迅速剪断胸骨,稍用力遂可挤出跳动的乳鼠心脏,更换另一把无菌眼科剪快速取下暴露的心尖部位,大小为2 mm×2 mm×2 mm,将取下的乳鼠心尖置于装有预冷的D-Hanks 液的玻璃培养皿中,更换无菌组织剪进行心尖组织的初步粗剪,用3 mL 吸管在含D-Hanks 液的玻璃培养皿中将心尖组织进行轻轻吹洗操作,以尽可能除去残留的血细胞,更换D-Hanks 液轻轻吹洗3 次或4 次,至组织块颜色变白,更换无菌组织剪将其剪成大小约1 mm3小块后转移至15 mL 离心管中。加入约10 倍体积的0.25%胰蛋白酶消化液,离心管中轻轻吹打将消化液混匀,置于37.0 ℃、5%CO2培养箱中消化4 min 后用吸管轻轻吹打离心管中心尖组织块约30 s 以分散细胞,待组织块自然沉降后,弃掉含消化液的上清液。重复以上操作,每次消化约5 min 后收集细胞,置于冰盒中等量的含10%胎牛血清、1%青链霉素、89%DME/F-12 的完全培养液中终止胰酶消化。其中胰酶消化第2 次时组织块即可成为黏稠丝状物质,基本分次消化4 次或5 次时组织块可消失。将分次收集到的细胞悬液以1 000 r/min,5 min 集中离心沉淀,所获细胞沉淀加入适量完全培养液,用吸管轻轻反复吹打分散细胞,用3 mL 离心管将含悬浮细胞的完全培养液接种均分装到5 个培养瓶中,每瓶加入完全培养液4 mL,放入37.0 ℃、5%CO2培养箱中放置1 h 后(差速贴壁分离法),轻轻吸出上悬液后弃掉,加入2 mL D-Hanks 液漂洗弃掉,再加入完全培养基4 mL 后将培养瓶放入恒温培养箱中培养。24 h 后进行第1 次D-Hanks 液漂洗、完全培养液换液,之后每间隔48 h 进行1 次换液。当心肌成纤维细胞培养至80%～90%融合时,以0.25%胰蛋白酶消化传代(1∶2),第2 代～第3 代细胞用于实验及鉴定。

1.2.2 形态学观察 在倒置生物显微镜下观察心肌成纤维细胞从刚接种时的悬浮状态,到逐渐贴壁、爬片融合成片层的变化过程。显微镜下对心肌成纤维细胞的外观形态、大小特征,内部细胞核特征以及心肌成纤维细胞的生长、增殖等情况进行直接观察并照相记录。观察时间尽可能控制在10 min 内,以免细胞长时间离开培养箱,尤其注意不要使细胞受到污染[2-4]。

1.2.3 Vimentin 免疫组化法鉴定[5-6]取第2 代的心肌成纤维细胞,105个/mL 接种于6 孔板中,每孔2 mL,爬片2～3 d 后处理,预冷(4 ℃),0.01 mmol/L 磷酸缓冲盐溶液(PBS)轻轻冲洗细胞爬片3 次,每次5 min,室温下75%乙醇固定30 min,PBS 溶液重复上述步骤冲洗,3%甲醇-过氧化氢孵育10 min 以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS 溶液冲洗,0.1% TritonX-100 室温处理15 min,PBS 溶液冲洗,5%BSA 小牛血清室温封闭1 h,加入一抗(1∶200)置于4 ℃冰箱中湿盒孵育过夜,复温,PBS 液冲洗,加入二抗(1∶200)室温避光1 h;PBS 溶液冲洗,加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP;1∶300)室温避光45 min,PBS 溶液冲洗,加入DAB 显色液,随时在显微镜下观察,细胞内出现黄色或棕黄色颗粒时将玻片放于清水中终止反应;苏木精复染细胞核2 min,清水洗4次或5 次,进行梯度乙醇脱水各3 min,以及二甲苯透明Ⅰ、Ⅱ各3 min;取适量树胶进行最后封片处理。在普通光学显微镜下进行观察、拍照记录[3]。PBS 代替一抗为空白阴性对照。

2 结 果

2.1 倒置显微镜下形态学观察 原代培养的心肌成纤维细胞刚分离时呈大小不一的圆形,折光性强,悬浮于培养液中,尚未贴壁。1 h 后可见大部分心肌成纤维细胞已贴壁,折光性较前变弱。1.5 h 后可见心肌成纤维细胞基本已完全贴壁生长且部分细胞有伪足伸出(小突起),均匀分布于培养基中,可见清晰细胞核,无聚集成团生长。24 h 后可见细胞呈长梭形、多角形或泡状生长,胞体相对心肌细胞较大,胞浆呈透明无色,细胞核较大,核呈色淡的椭圆形,多数细胞呈双核和三核。心肌成纤维细胞生长迅速,2～3 d 即可融合成片层,细胞呈紧密排列状态,偶可呈现交叉、重叠生长,一般无聚集成团生长,培养过程中细胞未见明显自发搏动。详见图1。

图1 倒置显微镜下心肌成纤维细胞的形态学变化

2.2 Vimentin 免疫组化法鉴定结果 阳性结果判断[2]:心肌成纤维细胞波形蛋白呈强阳性反应,以细胞浆内围绕细胞核呈黄色或棕褐色颗粒状改变为阳性。阴性结果判断[2]:心肌成纤维细胞波形蛋白免疫组化空白对照不着色即为阴性。Vimentin 免疫组化法进行心肌成纤维细胞鉴定,结果发现细胞波形蛋白染色呈强阳性反应,因此,采用胰蛋白酶消化,经差速贴壁分离法得到的细胞即为心肌成纤维细胞。详见图2。

图2 Vimentin 免疫组化法阳性鉴定结果

3 讨 论

目前心血管疾病已成为威胁人类健康的重要病种之一,而心力衰竭又是心血管疾病终末期阶段,其病理生理学改变主要为心肌纤维化,其又是多种心脏疾病发生、发展的重要危险因素,致心脏重构,进而致重构的心室顺应性差,严重影响心脏的舒张与收缩功能,导致心功能进一步向失代偿期进展。而成纤维细胞是心肌梗死后心力衰竭病人心肌纤维化的主要功能细胞,对心室重构起到了关键作用[7]。陈希等[8]认为心肌成纤维细胞不仅对心肌细胞有保护作用,而且还能影响心肌细胞的结构和生理功能。因此,对成纤维细胞的生理学研究也成为心血管疾病研究的热点问题。本实验通过分析心肌组织处理及细胞分离过程中的相关参数,证实了采用胰蛋白酶消化经差速贴壁法分离心肌成纤维细胞进行体外培养方法完全可行,为体外实验研究的开展提供了保障。

在心肌成纤维细胞的原代培养过程中应注意以下几点:①本实验选用出生48 h 以内新生SD 乳鼠,原因在于心肌细胞随着大鼠年龄的增长,其增殖分化能力也随之减弱,心肌成纤维细胞增殖能力亦然,因此,选择鼠龄时,尽量选择出生时间短的乳鼠,成纤维细胞成活率及贴壁率会更高,利于实验研究[4]。②胰蛋白酶消化心脏组织。孙刚等[9]通过胶原酶+胰蛋白酶消化法和单纯采用胰酶消化法对新生大鼠心肌组织进行消化培养发现,单独采用胰蛋白酶消化法获得的心肌成纤维细胞对药物具有更强的增殖反应能力,本实验也证实了单纯采用胰蛋白酶消化心脏组织提取心肌成纤维细胞是可行的,另外,本实验注意控制消化过程中的温度,一般在37.0 ℃,温度过低可能导致组织块消化不充分,温度过高不仅降低酶的活性也会对细胞造成损害,进而影响心肌成纤维细胞贴壁速度以及质量。③离心速率选择1 000 r/min,时间控制在5 min,目的是减少对心肌成纤维细胞的机械性损伤。④本实验采用差速贴壁法除去大部分心肌细胞,利用心肌成纤维细胞较心肌细胞贴壁快的特性1 h 时弃掉上层悬浮液[10],加用D-Hanks 漂洗减少了心肌细胞的存留机会,进而保证了心肌成纤维细胞的纯度,且操作简便、重复性良好。⑤本实验方法基本满足2 只新生SD 乳鼠配一个25 mL 培养瓶,且保证了细胞密度及存活率,满足36～72 h 可传代1 次的要求。