郭永杰，滕 青，杨志超，刘生玉，温全宝

(太原理工大学矿业工程学院，山西 太原 030024)

粉煤灰是煤炭燃烧的主要副产品，2018年中国粉煤灰年产量达7.3亿t，产量和储量均为世界第一位。山西省作为燃煤大省，清洁高效的利用粉煤灰，是建设和完善资源导向型经济不可或缺的一环[1]。粉煤灰主要由硅和铝的氧化物组成，利用化学工艺脱硅和除铝是目前主要的研究方向，但实验流程和所用药剂对环境污染大且成本较高[2-3]。

微生物作为生物圈中重要的分解者，其自身生命活动和酸性代谢产物在岩层风化中扮演重要角色。钟婵娟等[4]和张贤珍等[5]研究表明，微生物增殖和代谢产生的酸性物质会选择性地与不同结构硅酸盐发生络合作用或鳌合作用，使其中的离子溶出，达到元素分离和富集的目的。而微生物吸附于矿样表面后对矿物的钻孔、劈裂的作用也对矿样溶蚀产生一定促进作用[6]。当前微生物浸矿的研究主要集中于铝土矿等硅酸盐化合物的生物脱硅，也有很多学者将芽孢杆菌、黑曲霉和氧化亚铁硫杆菌等菌株应用于对矿物中铜、铁、钾、铀和稀有元素的浸出并取得良好效果[7-9]。使用微生物对矿物中有价离子进行浸出，相比于传统化学方法具有流程简单、可持续反应、环境污染小等优点[10-11]。粉煤灰中含有莫来石、石英和无定型玻璃体等大量硅酸盐化合物，常用于分解硅酸盐矿物的细菌如芽孢杆菌和曲霉广泛存在于土壤中[12]。以芽孢杆菌对粉煤灰进行生物浸出，探究其生物脱硅的最佳条件和浸矿机理，可以实现降低粉煤灰中SiO2含量而提高Al、Mg、Ca、Mn等元素品位的目的，进而为这些有用元素的提取创造有利条件[9,13-14]，同时脱硅液可研究制备白炭黑[15]，也可为后期通过诱变育种以获得高效脱硅菌株提供理论数据。此外，提取有用元素后的微生物脱硅液中含有离子态硅元素和丰富的有机物质，能够作为一种适宜的肥料[16]。

目前，国内外鲜有对粉煤灰生物浸出的相关研究报道。本文选用一株筛选出的解淀粉芽孢杆菌，研究其最适生长和浸矿条件，以及在浸出过程中Si2+的溶出效果。并使用SEM-EDS和FTIR对矿物进行表征形态观察，分析菌种浸矿机理，为后续生物脱硅实验的设计和操作提供理论依据。

1 实 验

1.1 材料

1.1.1 实验材料

用于菌种分离所需的土壤样品取自山西省太原市太原理工大学虎峪校区。

实验所用粉煤灰取自山西省太原市西山煤电厂，其化学成分和粒度分级分别见表1和表2。

细菌培养和浸矿所需培养基为察氏琼脂培养基(Czapek’s Agar)，配方如下：蔗糖30 g/L，NaNO33 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，K2HPO41 g/L，琼脂13 g/L，无菌水1 000 mL。其中琼脂根据所需培养基性状添加，并使用HCl和NaOH调整培养基初始pH值为7.2，灭菌备用。

1.1.2 浸矿菌种的筛选鉴定

将取得的土壤样品稀释于100 mL无菌水中，取上清液加入到无菌培养基中摇床培养3 d后静置，用无菌管取上清液1 mL注入装有9 mL无菌水的玻璃管中吹吸3次混匀。用此稀释方法制得10-5、10-6和10-7稀释度的菌液并涂布于无菌平板培养基中，置于培养箱中光照培养。待其生长出单菌落后用接菌针挑取并接种于液体培养基中。重复纯化操作3～4次，将得到的纯化菌株编号保存。将纯化菌株接种于100 mL Czapek’s培养基中培养5 d，取6 mL菌液接种于100 mL浓度6%的粉煤灰矿浆中摇瓶浸出7 d，使用硅钼蓝分光光度法测定矿浆中Si2+含量，得到一株有脱硅效果的菌株。经生理生化和16sRNA鉴定为解淀粉芽孢杆菌，其菌落SEM照片如图1所示。将菌株命名为ZGW-12，在100 mL液体培养基中摇瓶培养3 d后作为浸矿菌种备用。

表1 粉煤灰化学成分分析

表2 粉煤灰粒度分析

图1 ZGW-12解淀粉芽孢杆菌SEM图

1.2 实验方法

1.2.1 Si2+含量、Al3+含量和菌液浓度检测

Si2+含量和Al3+含量测定：使用硅钼蓝分光光度法和铬天青S分光光度法测定矿浆中Si2+含量和Al3+含量，制备标准样测定标准曲线如图2(a)和图2(b)所示，求得标准液中Si2+含量和Al3+含量与吸光度的线性回归方程[17-18]。

取培养2.5 d的ZGW-12菌液，将其稀释为不同倍数通过稀释涂布平板法确定菌液浓度，同时测定相应的吸光度值(600 nm处)， 以低于0.7的OD600值为横坐标，相应菌液浓度为纵坐标作图得线性回归方程如图2(c)所示[19]。

测定吸光度时如实测OD值大于0.7，需稀释待测液至吸光度为0.7以下，测定值依稀释比例换算为实际值。

图2 Si2+、Al3+和细菌数目标准曲线

1.2.2 细菌培养和浸出条件的优化

向250 mL锥形瓶中添加100 mL液体培养基，灭菌后接种菌6 mL，设置摇床(智城恒温培养振荡器ZWY-2102)转速为150 r/min，使用比色法测定不同温度、接菌量和转速下的菌种生长情况，研究其最适培养条件。 根据所得最适培养条件测定ZGW-12生长曲线，取进入稳定期的菌液作为生物浸出所用接菌液。

将粉煤灰置于干燥箱中75 ℃烘干24 h后将其中结块物质全部碾碎为粉末，向100 mL液体培养基中添加6 g矿样并灭菌，并设置摇床转速为150 r/min。研究ZGW-12浸矿所需最适的温度、接菌量、转速和矿物添加量。将粉煤灰进行粒度组成分析，并对筛分后的不同粒度粉煤灰浸矿脱硅，研究粒度对Si2+浸出的影响。

除非特殊说明，否则对细菌培养和浸出的各因素研究均在前期实验所得最适培养条件下开展。

1.2.3 细菌对粉煤灰的浸出实验研究

应用实验得到的最适浸出条件对粉煤灰浸矿脱硅31 d，测定Si2+溶出量和Al3+溶出量，研究细菌脱硅能力。通过SEM-EDS观察矿样表面形貌和组成成分含量变化；使用FTIR对原矿和浸矿处理后的矿样检测分析，比较浸矿前后吸收峰值变化，从而确定菌种脱硅效果。

2 结果与分析

2.1 细菌培养和浸矿条件优化

2.1.1 温度对细菌生长与浸矿效果的影响

图3为培养2.5 d后菌液浓度和浸矿6 d后矿浆中Si2+浓度变化曲线。对比图3(a)和图3(b)发现培养温度低于30 ℃时菌液浓度随培养温度的升高而增大，同时矿浆中Si2+浓度逐渐升高；当环境温度高于30 ℃时菌液浓度随温度升高而降低，矿浆中Si2+浓度也保持这一趋势；表明细菌生长和Si2+浓度变化趋势基本相同，细菌数目直接影响粉煤灰的脱硅效果。由图3可知，ZGW-12对环境温度较为敏感，且30 ℃为细菌繁殖和脱硅的最佳温度。细菌在一定的温度范围内繁殖和浸矿效果最佳，所以适宜的温度是细菌生长和浸矿实验中不可或缺的条件。低于细菌的最适温度，会使细胞中生物酶活性降低，生命代谢和增殖速度也会降低；而温度过高，不仅会使其蛋白质失活，更会使细胞膜通透性发生改变，胞内生物化学反应停止，造成细胞死亡。同时相关研究表明芽孢杆菌属种在生长过程中会产生酸性代谢物质[20]，这些物质可以与矿物中的成分发生反应使其分解，使Si2+溶于矿浆中；温度的改变会影响细菌产酸能力，从而影响其脱硅能力。所以将后期浸矿实验最适温度确定为30 ℃。

图3 不同温度对细菌生长和脱硅效果的影响

图4 不同初始接菌量对细菌生长和脱硅效果的影响

2.1.2 初始接菌量对细菌生长和浸矿效果的影响

不同初始接菌量下细菌生长和浸矿脱硅结果如图4所示。不同初始接菌量下菌液浓度见图4(a)。随初始接菌量增加，2.5 d后培养基中细菌浓度呈现先增加后减少的趋势。其中初始接菌量5 mL时生长效果达到4.3×108个/mL。初始接菌量影响着培养基中初始细菌含量和细菌繁殖速度，当初始接菌量过低时菌种初始繁殖速度较慢，影响其单位时间内繁殖数量；一定转速下溶液中氧气溶解量相对恒定，当初始接菌量过高时细菌初始繁殖速度快，培养基中所含氧气不足以维持菌体细胞完成充分的有氧呼吸，导致菌种活性降低，繁殖速率减慢。 且培养基中营养物质有限，菌种在较早的时间达到环境容纳量上限，接着部分发生死亡，使得细菌浓度降低。

图4(b)为不同初始接菌量下浸矿7 d后矿浆中Si2+浓度曲线，由图4(b)可知,ZWG-12脱硅的最佳初始接菌量为5～8 mL。与图4(a)相比，相同初始接菌量下细菌脱硅能力与繁殖速度略有不同，因为粉煤灰是多元素聚合体，其中部分元素会对浸矿菌种的生长或细胞活性产生影响，如促进其分泌更多的酸性代谢产物或者增强其细胞中生物酶活性，使其脱硅能力增强。由此确定细菌培养和浸矿脱硅初始接菌量均为5 mL，菌群数约为2.1×109个。

2.1.3 转速对细菌生长和浸矿效果的影响

图5为不同转速对细菌生长和脱硅效果的影响。图5(a)为菌种培养2.5 d后的细菌浓度曲线，由图可知在125 r/min条件下细菌培养效果最佳。浸矿7 d后Si2+浓度曲线如图5(b)所示，当转速大于150 r/min后，矿浆中Si2+浓度保持在185 mg/L左右，细菌脱硅效果保持相对稳定。解淀粉芽孢杆菌为好养菌，主要以呼吸产生能量，富氧环境利于其代谢繁殖，当培养基以葡萄糖为碳源时菌种可进行厌氧繁殖[20]，但细胞活性弱。其被认为是枯草芽孢杆菌的变种细菌之一，两者基因序列有很高的亲缘性，菌种理化性质相似。结合图5(a)和5(b)分析发现摇床转速对于细菌培养和脱硅效果影响不同。通过设定不同的摇床转速不但可以控制溶液中氧气的溶解量，还可以影响矿物颗粒与细菌个体之间的接触，从而影响细胞对矿物的吸附程度。当转速过低时培养基中氧气含量不足以维持细胞的好氧生长，细菌增殖缓慢；当转速过高时，氧含量增加使细胞代谢加快，短期产生大量有害代谢废物，抑制细胞增殖。 而在矿浆中因为有粉煤灰颗粒的存在，细菌代谢产生的物质会吸附于粉煤灰或与其中成分发生生物化学反应而有所消耗，使得在更高的转速下菌种有较好的生物脱硅能力。 另外粉煤灰的存在也可能会影响矿浆中溶解氧气的能力。 根据实验结果，确定细菌培养和后续浸矿实验所用转速分别为125 r/min和150 r/min。

图5 不同转速对细菌生长和脱硅效果的影响

2.1.4 矿浆浓度对浸矿效果的影响

图6为接菌5 mL对不同浓度矿浆浸矿7 d的脱硅结果。 由图6可知，矿浆浓度为7.5%以下时，随着矿浆浓度的增加，浸矿后Si2+浓度随之增加；当矿浆浓度为7.5%～12.5%时，Si2+浓度基本保持不变；当矿浆浓度大于12.5%时Si2+浓度有所降低。微生物浸矿脱硅过程中，接菌量与矿浆浓度需保持一定比例，使得微生物及其代谢产物可以与矿物充分接触并发生反应。当粉煤灰添加不足时，实验前期粉煤灰中活性物质即被微生物分解完毕；当粉煤灰添加量过高时，在摇瓶浸矿过程中矿物颗粒间相对距离不足，更易发生碰撞和摩擦，不仅使细菌难以吸附于矿物颗粒表面，也会使得细胞受到损伤无法达到最佳的浸矿效果。所以，从细菌和矿物充分反应的角度考虑，选择最适矿浆浓度为7.5%。

图6 矿浆浓度对细菌浸出的影响

2.2 最适条件下细菌生长曲线和脱硅实验

在前期实验所得最适温度、转速、初始接菌量和矿浆浓度的条件下测定菌种生长曲线和Si2+浓度、Al3+浓度如图7所示。 由图7(a)可知，ZGW-12增殖呈现前期缓慢，进入指数增长期(1.5～4 d)后快速繁殖，之后菌液浓度呈现相对稳定的整体趋势。 菌液中细菌最大数值可达到8.9×108个/mL，培养4 d时细菌浓度可达到8.5×108个/mL，接近于培养基能容纳的最大菌液浓度，所以将浸矿所需接菌液的培养天数确定为4 d。

将100 mL浓度为7.5 %的粉煤灰矿浆灭菌并接种5 mL菌液，菌群数约为4.2×109个，在30 ℃和150 r/min条件下摇瓶浸出31 d，测定Si2+浓度曲线和Al3+浓度曲线如图7(b)所示。由图7(b)可知，随浸矿时间增加，矿浆中Si2+浓度逐渐增加，到19 d时达到306 mg/L，之后略有下降；而Al3+浓度基本保持在0.5 mg/L，ZGW-12在实验中对粉煤灰表现出良好的脱硅提铝效果。实验前期矿浆中含有充足的营养物质，随着浸矿时间增长细菌大量繁殖并产生多种酸性代谢物对粉煤灰颗粒进行溶蚀，使得Si2+浓度持续升高。浸矿后期(19 d以后)矿浆中营养物质随着细菌生长和脱硅反应消耗殆尽，细菌开始利用前期溶出的Si2+作为维持自身生命活动的替代物质，使得矿浆中Si2+浓度逐渐降低，并随着细菌的逐渐死亡最终浓度保持相对稳定[6]。浸矿过程中微生物通过自身生命活动破坏矿物结构构造，并且其酸性代谢物会解离成H+和有络合能力的有机配位体。不断析出的H+与矿物中硅酸盐成分发生酸解反应，有络合能力的有机配位体与矿样中析出的Si2+形成络合物溶于矿浆，而这些配位体与Al3+形成的有机酸-Al多聚物则形成沉淀附着于粉煤灰颗粒表面，形成浸出后矿样中Si2+含量降低而Al3+含量升高的现象[21]。

图7 最适条件下菌种生长和浸矿31 d Si2+浓度、Al3+浓度曲线

2.3 粒度对浸矿效果的影响

图8为不同粒度粉煤灰脱硅结果。由筛分分析可知实验所用粉煤灰包含不同粒度，其中粒度小于38 μm的粉煤灰占比最多。不同粒度粉煤灰各取7.5 g浸矿7 d，发现粒度小于75 μm的脱硅效果优于粒度大于75 μm的粉煤灰。 其中粒度为38～45 μm的粉煤灰脱硅效果最好，可以达到200 mg/L。由此可知在浸矿脱硅过程中，溶出的Si2+主要来源为粒度小于75 μm的粉煤灰。 原因是当矿样颗粒变小，能与矿浆中细菌酸性产物反应的比表面积增大，其中的硅酸盐化合物更易被酸性物质分解而溶于矿浆中。

图8 不同粒度粉煤灰脱硅效果

2.4 矿样SEM-EDS分析

图9(a)和图9(b)分别为浸矿前和浸矿5 d时粉煤灰SEM图。从图9(a)可以看出，粉煤灰原矿大部分为颗粒状且表面平整的玻璃微珠，少量为不规则块状，大小从几微米到上百微米不等。玻璃微珠粒径和密度不同，其化学特征和矿物学特性也有一定差别，一般粒度越小越易于与酸性物质反应[22]，这与图8中不同粒度粉煤灰的浸出结果相符。由图7(a)可知，菌种培养4 d后达生长稳定期，为尽可能清晰观察细菌在矿物表面的吸附状态，选取浸矿5 d的粉煤灰通过SEM观测见图9(b)。图9(b)为生物脱硅过程中形成的细菌-矿物复合体。微生物在浸矿过程中存在细菌本身的直接吸附和分泌酸性产物的间接溶蚀作用[23]；在浸矿过程中，细胞分泌大量的多糖类物质促进其吸附于矿物表面[24]。对于细菌吸附性研究，孙德四等[25]认为细菌个体通过对矿物的吸附而获取生长所需的营养元素；钮因健等[26]认为是细胞产生大量多糖使其粘附于矿物表面；也有研究者认为不同菌种细胞表面电负性不同，与特定矿物作用时会发生静电吸附作用[27]。

图10为粉煤灰原矿和浸矿31 d后矿物EDS分析结果。由图10可以看出，经生物浸矿处理后粉煤灰中Si、Al占比分别从25%和20.53%变为22.93%和21.81%，Si含量占比降低而Al含量占比增高，说明ZGW-12对粉煤灰有脱硅提铝的作用，与图7(b)中浸矿脱硅31 d的实验结果相符。同时，粉煤灰中Fe含量和K含量也略微降低，说明菌种对这两种元素也有一定的浸出作用。

图9 浸矿前后粉煤灰SEM图

图10 粉煤灰原矿和浸矿31 d粉煤灰EDS分析结果

2.5 粉煤灰红外光谱分析

图11 粉煤灰原矿与浸矿31 d的粉煤灰FTIR图

将粉煤灰原矿和浸矿处理31 d的粉煤灰50 ℃烘干后经FTIR分析如图11所示。峰值3 450 cm-1处附近O—H伸缩振动峰(—OH和—NH带的组合)强度有所增强，有文献报道微生物分泌的有机酸会与硅酸盐矿物发生羟基化反应[28-29]。在浸矿实验中，细菌在矿浆中快速繁殖，并吸附于矿物表面。经烘干处理后微生物细胞膜和细胞质等蛋白类物质(含有氨基)残留于矿物表面造成3 450 cm-1峰值上升，说明在浸矿过程中有细菌个体吸附于矿物表面[23]。峰值为1 100 cm-1左右的O—Si—O伸缩振动峰强度较浸矿前明显减弱，说明矿物中有大量Si—O键在浸矿过程中被破坏。

3 结 论

1) 经分离鉴定，浸矿所用菌种为解淀粉芽孢杆菌。经实验确定菌种最适培养条件为：100 mL液体培养基中接菌5 mL，在30 ℃和125 r/min下培养4 d达到生长稳定期。

2) 实验确定粉煤灰浸矿条件为：100 mL浓度为7.5%的矿浆中接菌5 mL，在30 ℃、150 r/min下摇瓶浸矿。矿浆中Si2+浓度在19 d时达到306 mg/L，而Al3+浓度基本保持在0.5 mg/L。

3) 浸矿过程中细菌会与粉煤灰颗粒形成复合体；同时矿样Si—O振动峰降低，说明菌种及其代谢产物会分解矿样中硅酸盐化合物使Si2+溶于矿浆中。实验结果表明ZGW-12可以将粉煤灰中硅元素浸出的同时保留铝元素，降低矿样硅铝比。