细胞核内的遗传物质，它在肿瘤的形成和发展过程中起着重要的作用。核外的线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是在具有DNA基因组的细胞中存在的唯一的核外遗传物质。这种遗传物质具有DNA基因组，能够自主复制。因线粒体内氧浓度较高，长期暴露于这种高浓度氧环境下的mtDNA容易发生突变。其中mtDNA的1 120 bp（16025-576）组成的D环区是突变的热点所在，其在肿瘤发生发展中的作用正备受关注，在胃癌、肠癌、鼻咽癌等实体恶性肿瘤中，已见到针对该区域相关突变位点的相关报道，但这些报道均未涉及mtDNA在恶性肿瘤发生和演变中的作用和机制。本研究于2017年1月至2019年6月将肺癌细胞突变mtDNA片段转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3，观察mtDNA片段在成纤维细胞核内的整合情况，并观察转染细胞的生物学行为变化，以探讨变异的mtDNA在肿瘤发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3及肺癌细胞A549、H226购于上海福祥生物科技有限公司。G480、脂质体转染Lipofection2000转染试剂均购自英韦创津（Invintrogen）公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶购自Gibco公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT），二甲基亚砜（DMSO）、姬姆素染料（Giemsa stain）购自Sigma-Aldrich公司。本课题组将突变的肺癌细胞mtDNA的D环区插入到pcDNA3.1（+）载体BamH I，构建了XhoⅠ位点间的重组表达载体。分别命名为pcDNA3.1（+）-A549 mtDNA、pcDNA3.1（+）-H226 mtDNA；mtDNA提取试剂盒购自杭州维特洁（V-gene）生物技术公司；荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）试剂盒购于天津灏洋生物科技公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）是从上海碧云天生物科技有限公司购得的。流式细胞仪购自Epics Elite，Coulter Corporation，U.S.A。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养 将NIH3T3、A549及H226细胞在含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培养基中传代培养，待生长至对数生长期时，用适当量的9 g/L胰蛋白酶消化后，培养贴壁生长良好的细胞。……